壮药蛇尾草HPLC指纹图谱及抗氧化活性的谱效关系

马雯芳 吴剑丽 张秀丽 蓝昌斌 甘洁雪 周华锋 王剑

收稿日期：2023-09-25

基金项目：壮瑶药协同创新中心项目（桂教科研［2013］20号）；广西壮瑶药重点实验室项目（桂科基字［2014］32号）；广西重点学科壮药学项目（桂教科研［2013］16号）；广西协同创新中心壮瑶药协同创新中心科研项目（ZYXT［2015］-13）

作者简介：马雯芳（1983-），女，广西南宁人，教授，博士，主要从事中药品种鉴定与品质评价研究工作，（电话）0771-4953513（电子信箱）

109348793@qq.com；通信作者，王 剑（1981-），讲师，硕士，主要从事中医药数据挖掘的研究工作，（电话）0771-4953513

（电子信箱） 43582538@qq.com。

马雯芳，吴剑丽，张秀丽，等. 壮药蛇尾草HPLC指纹图谱及抗氧化活性的谱效关系［J］. 湖北农业科学，2024，63（5）：84-90．

摘要：为研究壮药蛇尾草高效液相（HPLC）指纹图谱及抗氧化活性间的谱效关系，建立了蛇尾草药材高效液相指纹图谱，采用1， 1-二苯基-2-三硝基苯肼法（DPPH）和铁离子还原能力法（FRAP）对蛇尾草抗氧化活性进行评价，结合聚类分析、主成分分析和偏最小二乘分析对蛇尾草抗氧化活性进行谱效分析。结果表明，以3号峰（毛蕊花糖苷）为参照峰，确定了11个共有峰，大部分批次蛇尾草的相似度>0.900；通过聚类分析和主成分分析，可将22 批样品分为两类；不同产地间蛇尾草毛蕊花糖苷含量在0.38%～4.82%；22批蛇尾草抗氧化活性良好，共有峰1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、8、10、11与DPPH自由基清除率呈正相关，1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、10号峰与铁离子还原能力呈正相关。建立的蛇尾草HPLC指纹图谱可靠、准确，可为蛇尾草抗氧化活性物质的筛选及质量控制提供参考。

关键词：蛇尾草；指纹图谱；聚类分析；主成分分析；抗氧化活性；谱效关系；偏最小二乘回归分析

中图分类号：S567.21；R285.5         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）05-0084-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.015            开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

HPLC fingerprint and its spectral effect relationship with antioxidant activity of Zhuang medicine Pogonostemon auricularius （L.） Hassk.

MA Wen-fang， WU Jian-li， ZHANG Xiu-li， LAN Chang-bin， GAN Jie-xue， ZHOU Hua-feng， WANG Jian

（Faculty of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning  530001， China）

Abstract： Aiming to study the relationship between high performance liquid ehromatography （HPLC） fingerprint and antioxidant activity， the HPLC fingerprint of Pogonostemon auricularius （L.） Hassk. was established. Combing with Cluster Analysis， Principal Component Analysis， and Partial Least Squares Regression Analysis， the antioxidant activity of Pogonostemon auricularius （L.） Hassk.was evaluated by 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） and ferric reducing ability of plasma （FRAP） methods. The results showed that eleven common peaks were identified with peak No. 3 （verbascoside） as the reference peak， and the similarity of most batches of Pogonostemon auricularius （L.） Hassk. was greater 0.900. Through cluster analysis and principal component analysis， twenty-two batches of samples could be divided into two categories. The content of verbascoside in Pogonostemon auricularius （L.） Hassk. from different producing areas ranged from 0.38% to 4.82%. The antioxidant activity of twenty-two lots of Pogonostemon auricularius （L.） Hassk. was good. Peaks 1， 2， 3（verbascoside）， 6， 8， 10， and 11 were positively correlated with DPPH free radical scavenging rate， peaks 1， 2， 3（verbascoside）， 6， and 10 were positively correlated with iron ion reducing ability. The established HPLC fingerprint was reliable and accurate， which could provide reference for the screening and quality control of antioxidant active substances of Pogonostemon auricularius （L.） Hassk.

Key words： Pogonostemon auricularius （L.） Hassk.； fingerprint； cluster analysis； principal component analysis； antioxidant activity； spectrum effect relationship； Partial Least Squares Regression Analysis

蛇尾草又名毛水珍珠草、水珍珠菜、水毛射，为唇形科刺蕊草属植物水珍珠菜［Pogostemon auricularius （L.） Hassk.］的全草， 其味淡，性凉，有散风清热、消炎止痛、祛湿、拔毒生肌的功效；用于感冒发热、皮肤溃疡、咽喉肿痛、风湿痛、惊风、毒蛇咬伤［1-4］，生于广西、广东、福建、台湾及云南疏林下湿润处或溪边近水潮湿处，蛇尾草为壮族常用民间草药［5-7］。壮医认为蛇尾草能调气机、止疼痛、通龙路、消肿痛；用于额哈（毒蛇咬伤）、坝农（痈疽）、能唅能累（湿疹）、林得叮相（跌打损伤）［8］。

目前已从基源、性状、显微、薄层色谱鉴别等方面对蛇尾草进行了研究，初步建立了蛇尾草的质量评价方法［9］，但鲜见对其指纹图谱的研究。指纹图谱结合化学模式识别已广泛用于民族药、中药的质量控制，可从整体上更客观地反映民族药、中药的质量，是评价药材质量的重要手段［10-18］。炎症和多种疾病与人体的自由基有关，体内过多的自由基会导致细胞损伤、慢性炎症，加速机体衰老，诱发各种疾病［19-22］，因此研究抗氧化成分及评价抗氧化活性的方法，对开发更多抗氧化剂具有重要意义。常用的体外抗氧化活性评价方法有DPPH自由基清除法、FRAP总抗氧化能力测定法、ABTS总抗氧化测定法、抗脂质过氧化能力测定法等，体外抗氧化活性评价方法简便、高效、快捷，但单一评价方法均不能直接反映总抗氧化活性，不同的抗氧化活性测定方法反应机理不同故而结果有差异，因此需采用多种测定方法综合评价抗氧化活性［22-24］。为此，本研究对22批蛇尾草建立HPLC指纹图谱，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼法和铁离子还原能力法对蛇尾草抗氧化活性进行评价，结合聚类分析、主成分分析进行共有峰分析，采用偏最小二乘法分析蛇尾草抗氧化活性谱效关系，以期为蛇尾草抗氧化活性物质的筛选及质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 SOP型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AgiLent 1260型高效液相色谱仪（美国AgiLent公司）；SYNERGYH1型酶标仪（美国伯腾公司）；DP5系列超纯水仪（美国密理博公司）。

1.1.2 试剂 毛蕊花糖苷对照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司；批号V101318，纯度≥98%）；乙腈（赛默飞世尔科技有限公司；批号204127；色谱纯）、甲醇（赛默飞世尔科技有限公司；批号207899；色谱纯）、2，4，6-三吡啶基三嗪（分析纯，Solarbio公司）、硫酸亚铁（分析纯，天津博迪化工股份有限公司）、1， 1-二苯基-2-三硝基苯肼（日本东京化成工业株式会社，批号6KCYN-LT）、盐酸（分析纯，廉江市爱廉化学试剂有限公司）、95%乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、超纯水。

1.1.3 药材 22批蛇尾草药材采自广西、广东各地，经广西中医药大学中药鉴定教研室蔡毅教授鉴定为唇形科刺蕊草属植物水珍珠菜的干燥全草，药材信息见表 1。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Inertsil ODS-3色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为乙腈-0.2%磷酸，洗脱程序为0～12 min，20%（乙腈）；12～20 min，20%～25%（乙腈）；20～30 min，25%（乙腈）；30～45 min，25%～35%（乙腈）；45～70 min，35%（乙腈）；进样体积为10 μL；柱温设置为30 ℃；检测波长310 nm；流速1.0 mL/min。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取毛蕊花糖苷对照品5.12 mg，用甲醇定容至10 mL，即得浓度为0.512 mg/mL的对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 精密称取蛇尾草药材粉末（过四号筛）0.3 g，加入25 mL的70%乙醇超声30 min，经离心后取上层清液滤过，即得。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度试验 取同一蛇尾草供试品溶液（S6），按“1.2.3”条件制备供试品溶液，按照“1.2.1”色谱条件测定 6 次，记录保留时间和峰面积。以3号峰（毛蕊花糖苷）的保留时间和峰面积作为参照，计算11个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果11个色谱峰相对保留时间的 RSD为 0.34%～0.55%，相对峰面积的 RSD为0.68%～1.95%，表明该仪器的精密度良好。

2.1.2 稳定性试验 取同一蛇尾草供试品溶液（S6），分别于制备后0、3、6、12、24、48 h，按照 “1.2.1”色谱条件测定，记录峰面积和保留时间。以3号峰（毛蕊花糖苷）为参照峰，结果测得11个共有色谱峰相对保留时间的RSD为0.13%～1.81%，相对峰面积的RSD为0.49%～2.07%，说明蛇尾草供试品溶液放置室温下在48 h 内稳定性良好。

2.1.3 重复性试验 精密称取同一批蛇尾草粉末（S6）0.3 g，称定 6 份，按“1.2.1”色谱条件测定。以3号峰（毛蕊花糖苷）为参照，结果测得11个共有色谱峰相对保留时间的RSD为0.07%～0.56%，相对峰面积的RSD为0.76%～2.24%，表明该方法重复性良好。

2.2 蛇尾草的指纹图谱与化学模式识别研究

2.2.1 HPLC指纹图谱建立 取22批蛇尾草样品制备供试品溶液，按照“1.2.1”色谱条件测定，将22批蛇尾草的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）”，参照图谱为S6，时间窗为0.2 s，得到22批蛇尾草HPLC指纹图谱叠加图，见图1。经查阅文献并通过对照品比对［9］，指认3号峰为毛蕊花糖苷，结果见图2。蛇尾草药材对照指纹图谱以中位数法生成，见图3。由于3号毛蕊花糖苷色谱峰的峰面积高且分离度较好，因此作为参照峰，计算各共有峰相对保留时间的RSD为0.12%～0.60%，相对峰面积的RSD为38.57%～118.92%，表明不同批次蛇尾草各成分种类基本相同，但是含量差异较大。

2.2.2 相似度评价 将22批蛇尾草样品的色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统（2012A版）”进行相似度评价，结果见表2。各批次蛇尾草相似度均大于或等于0.834，除S15和S21外，其余批次蛇尾草的相似度均>0.900，各批次蛇尾草药材的整体化学成分差异性较小。

2.2.3 聚类分析 将22批蛇尾草供试品共有峰峰面积的原始数据导入IBM SPSS Statistic 23.0软件，选择组间联接的方法，以余弦作为测量度，根据各色谱峰的峰面积对其进行系统聚类，输出聚类结果见图4。从聚类分析树状图中可以看出，当距离为24时，22批供试品分为两大类，S3、S21、S4为一类，S9、S10、S2、S8、S12、S16、S1、S7、S6、S18、S20、S5、S11、S14、S19、S13、S22、S17、S15为一类，表明不同批次的蛇尾草样品存在一定差异。

2.2.4 主成分分析 对22批药材共有峰的峰面积数据标准化处理后，导入IBM SPSS Statistic 23.0软件进行主成分分析，结果见表3。取主成分对应的特征值大于1 的前2个主成分［25-27］，主成分特征值分别为19.260、1.493，方差贡献率分别为87.545%、6.785%；前2个主成分的累积方差贡献率达94.330%，表明提取前2个主成分可表示蛇尾草药材中的大部分化学信息。以前2个主成分为变量，利用IBM SPSS Statistics 23.0软件绘制主成分得分，见图5，可以直观地显示样品之间的差异。由图5可知，S3、S4、S21批次与其他批次距离较远，主成分分析的结果与聚类分析的结果一致。

2.3 不同产地蛇尾草中毛蕊花糖苷含量的测定

2.3.1 线性关系考察 精密量取毛蕊花糖苷对照品溶液（0.512 mg/mL）0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 mL于2 mL的容量瓶中，配制成系列对照品溶液，按照“1.2.1”项色谱条件测定，将对照品质量浓度作为横坐标（X），以峰面积作为纵坐标（Y），回归方程为Y=   13 200.742X+4.502 511 8（r=0. 999 95），结果表明，在0.025 6～0.512 0 mg/mL范围内毛蕊花糖苷的质量浓度和峰面积的线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 取同一毛蕊花糖苷（0.204 8 mg/mL）对照品溶液，在“1.2.1”项色谱条件下测定 6 次，记录毛蕊花糖苷的峰面积，结果RSD为0.20%，显示该仪器的精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一蛇尾草供试品溶液（S6），分别于供试品制备后0、3、6、12、24、48 h，按照“1.2.1”项下的色谱条件进样测定。记录毛蕊花糖苷的峰面积，结果RSD为0.75%，说明蛇尾草供试品溶液中毛蕊花糖苷含量在48 h内稳定。

2.3.4 重复性试验 称取同一份蛇尾草粉末（S6）0.3 g，称定6份，制备蛇尾草供试品溶液，在“1.2.1”项条件下测定6次，记录毛蕊花糖苷的峰面积，结果RSD为2.60%，说明重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取蛇尾草粉末（S6）0.15 g，称定6份，制备蛇尾草供试品溶液，精密加入适量的对照品溶液，在“1.2.1”项色谱条件下测定，结果毛蕊花糖苷加样回收率为96.42%～99.16%，平均加样回收率为98.15%，RSD为1.08%。

2.3.6 含量测定 精密称取各批次蛇尾草粉末0.3 g，制备蛇尾草供试品溶液，在“1.2.1”项条件下测定，记录各批次毛蕊花糖苷峰面积，测得各批次蛇尾草药材中毛蕊花糖苷含量在0.38%～4.82%，结果见表4。

2.4 药效学研究

2.4.1 DPPH自由基清除率测定 取蛇尾草供试品溶液80 μL与60 μL 0.4 mmol/L的DPPH溶液，避光反应30 min，即得样品组溶液；供试品溶液80 μL与95%乙醇60 μL混匀，避光反应30 min，即得样品空白溶液；95%乙醇80 μL与60 μL 0.4 mmol/L的DPPH溶液混匀，避光反应30 min，即得对照溶液；试验平行3份。在517 nm测得A0、A1、A2。根据公式DPPH自由基清除率=［1-（A1-A2）/A0］×100%计算，得到自由基清除率为91.78%～95.67%，其中S9抗氧化能力最强，S4抗氧化能力最弱，结果见表5。

2.4.2 FRAP铁离子还原能力测定 在酸性环境下，抗氧化物质可以还原Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）生成蓝色的Fe2+-TPTZ［20］。取蛇尾草供试品溶液80 μL加入4 mL FRAP工作液中，避光静置40 min，于596 nm处测定吸光度。以FeSO4当量评价蛇尾草总抗氧化能力，不同批次蛇尾草FeSO4当量为101.34～264.73 mg/g，其中S8抗氧化能力最强，S12抗氧化能力最弱，结果见表6。

2.5 偏最小二乘回归分析

以11个共有峰的峰面积经Z-score标准化处理后为自变量，不同批次蛇尾草供试品抗氧化能力数据经Z-score标准化处理后为因变量，通过SIMCA 14.1软件偏最小二乘回归分析［28，29］，见图6、图7。结果表明，蛇尾草指纹图谱中峰1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、8、10、11与DPPH自由基清除率呈正相关，峰4、5、7、9则与DPPH自由基清除率呈负相关；1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、10号峰与铁离子还原能力呈正相关，而4、5、7、8、9、11号峰与铁离子还原能力呈负相关。与两个药效均呈正相关的是1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、10号峰。VIP是变量重要性值，可评价自变量对因变量解释的重要程度。对DPPH自由基清除率贡献较大的峰从大到小依次是9、2、3（毛蕊花糖苷）、4、10，对铁离子还原能力贡献较大的峰从大到小依次是2、9、1、3（毛蕊花糖苷）、6。结果表明蛇尾草各成分发挥抗氧化作用的途径各不相同，抗氧化作用是多种化学成分共同发挥作用的结果。

3 小结与讨论

试验前期分别采用不同浓度甲醇、乙醇和纯水作提取溶剂，对浸渍、回流、超声等方法的提取效果进行了比较，也对30、60、90 min不同提取时间进行考察，结果以70%乙醇25 mL超声提取30 min提取效率较高，峰信息较丰富，峰响应值较高。对乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1 %磷酸、乙腈-0.1 %磷酸、甲醇-0.2%磷酸不同流动相系统进行考察，结果发现，当流动相为乙腈- 0.2%磷酸进行梯度洗脱时各色谱峰有较好的峰形和分离度。试验对蛇尾草指纹图谱进行全波长扫描，对310、320、330 nm不同检测波长进行考察，在310 nm 波长下色谱峰较多，响应值较高。通过对色谱条件进行优化，建立了色谱峰较丰富、分离度好的蛇尾草HPLC指纹图谱。

试验采用HPLC法建立了22批蛇尾草的指纹图谱，其中3号峰为共有峰中最高峰，且保留时间适宜，故以3号峰毛蕊花糖苷为参照峰（S），共确定了11个共有峰，对22批蛇尾草药材样品的指纹图谱分析可知，其共有峰的相对保留时间之间存在的差异比较小，表明本研究建立的蛇尾草药材指纹图谱测定方法重复性良好，但不同批次蛇尾草药材相对峰面积差异较大，药材质量可能受地域环境、采收季节等影响较大。22批蛇尾草指纹图谱的相似度均大于或等于0.834，表明各批次蛇尾草药材的整体质量相对稳定，相似度较好。通过聚类分析和主成分分析，可知22 批蛇尾草样品分为2类，S3、S4、S21为一类，其余19批为一类，其可能与各成分含量比例差异有关。毛蕊花糖苷是蛇尾草药材中的主要成分，峰响应值最大，且是发挥抗氧化作用的活性成分，为了更好地评价蛇尾草药材的质量，在指纹图谱建立的基础上，对22批蛇尾草的毛蕊花糖苷进行了含量测定，结果显示22批蛇尾草中毛蕊花糖苷含量为0.38%～4.82%，平均值为2.50%，受不同产地、采收时间影响［30-34］，不同批次的蛇尾草中毛蕊花糖苷含量有较大差异。分别采用了DPPH法和 FRAP法对蛇尾草抗氧化活性进行评价，不同测定方法的反应机理不同而结果有差异，且不同批次蛇尾草各成分含量存在差异，因此需结合指纹图谱综合评价蛇尾草的质量。

本研究采用偏最小二乘回归分析探讨蛇尾草指纹图谱共有峰与抗氧化活性间的关联，建立谱效间的联系，筛选药效相关峰，初步确定蛇尾草发挥抗氧化活性的成分，结果发现蛇尾草指纹图谱中峰1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、8、10、11与DPPH自由基清除率呈正相关，1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、10号峰与铁离子还原能力呈正相关，表明蛇尾草各活性成分发挥抗氧化作用的途径各不相同，抗氧化作用是多种化学成分共同发挥作用的结果。但因蛇尾草基础研究较薄弱，蛇尾草抗氧化药效相关峰仅指认了毛蕊花糖苷，其余药效相关峰的鉴别有待进一步的研究。

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