中小叶种茶酯型儿茶素含量测定及亚细胞定位

2024-06-25满佳旭高梓琪武思敏王冬雪赵雪婷张冬英

湖北农业科学 2024年5期

满佳旭高梓琪武思敏王冬雪赵雪婷张冬英

摘要：为了明确酯型儿茶素在中小叶种茶叶中的亚细胞空间定位，以十里香、桂绿1号、浙农113、福鼎大白茶、浙农139共5种中小叶种茶样为试验材料，采用高效液相色谱法对5种茶样中的酯型儿茶素含量进行检测，采用中性红染色法对茶样细胞中液泡进行定位，通过免疫组织化学法对茶样中酯型儿茶素进行亚细胞定位。结果表明，5种中小叶种茶均含有不同含量的酯型儿茶素，其中含量最高的为十里香茶；在中性红染色情况下，十里香茶样中液泡呈圆形或椭圆形；免疫组织化学法染色情况下，5种中小叶种茶酯型儿茶素在亚细胞水平上均定位于液泡中。

关键词：中小种茶叶；酯型儿茶素；免疫组织化学法；亚细胞定位；含量测定

中图分类号：Q946.84+1 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）05-0098-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.017 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Content determination and subcellular localization of ester catechins of

small and medium-leaf teas

MAN Jia-xua，b， GAO Zi-qia，b， WU Si-mina，b， WANG Dong-xuea，b， ZHAO Xue-tinga，b， ZHANG Dong-yingb

（a.College of Food Science and Technology；b. Key Laboratory of Puer Tea Science，Ministry of Education，Yunnan Agricultural University，

Kunming 650000， China）

Abstract： In order to clarify the subcellular spatial localisation of ester catechins in small and medium-leaf teas， five small- and medium-leaf tea samples of Shilixiang， Guilv No.1， Zhenong 113， Fuding Dabai Tea and Zhenong 139 were taken as the test materials， and the content of ester catechins in the five tea samples was detected using high-performance liquid chromatography （HPLC）， and the vesicles in the cells of the samples were localised using neutral red staining. Subcellular localisation of ester catechins in tea samples was performed by immunohistochemistry. The results showed that all five types of small and medium-leaf teas contained different levels of ester catechins， with the highest content in Shilixiang tea； under neutral red staining， the vesicles in Shilixiang tea samples were round or oval； under immunohistochemistry staining， the ester catechins of the five types of small and medium-leaf teas were located in the vesicles at the subcellular level.

Key words： small and medium-leaf teas； ester catechins； immunohistochemistry； subcellular localisation； determination of content

收稿日期：2022-11-01

基金项目：国家自然科学基金项目（31760226）

作者简介：满佳旭（1998-），女，吉林白山人，在读硕士研究生，研究方向为皮肤光老化，（电话）18488812842（电子信箱）729241399@qq.com；通信作者，张冬英（1976-），女，教授，博士，主要从事茶及特色植物资源开发利用研究，（电子信箱）857173887@qq.com。

满佳旭，高梓琪，武思敏，等. 中小叶种茶酯型儿茶素含量测定及亚细胞定位［J］. 湖北农业科学，2024，63（5）：98-100．

云南省是世界公认的优质茶源，拥有得天独厚的地理环境，适宜茶树生长，茶叶的生产和加工也在云南省农业经济中有着举重若轻的地位。茶叶的种类繁多，根据树形和成熟后叶片面积进行分类，可分为大叶种、中叶种和小叶种。由于中叶种和小叶种差异不大，也常统称为中小叶种。目前关于中小叶种茶研究主要集中在茶多酚、咖啡碱、茶氨酸等茶叶内含成分检测方面［1-6］，而关于中小叶种酯型儿茶素的亚细胞定位研究较为鲜见［7］。酯型儿茶素主要积累于液泡、叶绿体及栅栏组织中，由于缺乏有效的特异性染色剂，常用的组织化学定位显色方法及染色剂无法特异性识别酯型儿茶素，容易出现假阳性的结果。免疫组织化学法通过利用抗原和抗体能够特异性结合的优势，能够直接定位细胞或者组织内小分子物质的特定表达，就茶叶中酯型儿茶素定位而言，该方法相较于普通的组织化学染色法更为可靠［8-10］。

液泡广泛存在于植物、动物、微生物等细胞中，是由单层膜和内部细胞液组成的细胞器，其细胞液中存储着多种物质。幼小的植物细胞（分生组织细胞）具有许多小而分散的液泡，在电子显微镜下才能看到。在植物细胞中，液泡的体积一般占总体积的70%～80%，随着细胞的生长，液泡也长大，互相合并，最后在细胞中央形成一个大的中央液泡，其可占据细胞体积的90%以上。随着液泡研究的深入，发现液泡的形态除了在不同物种中有差异性，更重要的是与其生长周期相关，也是高度动态的细胞器，能够快速对外界环境因素的变化进行响应，参与并调节细胞代谢，控制细胞内物质积累和运输，维持细胞内环境稳定，提高植物适应环境变化和生存的能力。

本试验通过高效液相色谱法对5种中小叶种茶进行酯型儿茶素含量检测，利用中性红染色对液泡进行定位，应用免疫组织化学法对茶样进行亚细胞定位，该结果可为中小叶种茶叶酯型儿茶素的生物合成途径、存储机制等资源开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器高效液相色谱仪（安捷伦1260型），安捷伦科技有限公司；低速离心机（中佳 SC-3616型），安徽中科中佳科学仪器有限公司；超声波清洗机（SK-18TC型），上海科导超声仪器有限公司；冷冻切片机（Leica CM1950型）、荧光显微镜（Leica DM2000型），德国徕卡（Leica）仪器有限公司。

1.1.2 试剂甲醇、乙腈（色谱纯），美国TEDIA“天地”公司；三氟乙酸（色谱纯），德国默克公司；中性红，上海源叶生物科技有限公司；OCT包埋剂，美国樱花；组织固定液，济南百博生物技术有限责任公司；多聚甲醛（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；DAB试剂盒，天根生化科技有限公司；苏木素，美国Sigma化学公司；抗酯型儿茶素抗体，自制。

1.1.3 试材选取十里香、桂绿1号、浙农113、福鼎大白茶、浙农5种中小种茶一芽两叶，来源于云南省普洱茶树良种场，采集时间为2021年4月。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理取5种不同的新鲜中小叶种茶样，洗净，擦去水渍后用液氮充分研磨；分别称取0.2 g（±0.0001 g）试样于15 mL离心管中，加入70%甲醇溶液（70 ℃水浴中预热）5 mL，放入70 ℃水浴锅中充分浸提10 min（隔5 min涡旋1次），待冷却至室温后以3 500 r/min离心10 min，将上清液转移至 15 mL离心管中。用0.45 μm滤膜过滤，取2～10 mL过滤液于容量瓶中，用稳定溶液定容至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，采用高效液相色谱法（HPLC）检测，HPLC条件参考文献［11］。

1.2.2 中性红染色法取新鲜的十里香茶样品于福尔马林中固定24 h，用刀片切成5 mm长的小段，放入OCT包埋剂中包埋，置于-80 ℃冰冻，利用冷冻切片机快速切片，展片。用去离子水清洗，随后用0.1%浓度的中性红溶液染色2 min，流水下冲洗 30 min，中性树脂封片后显微镜观察，拍照。

1.2.3 免疫组织化学法前处理同中性红染色，展片后用免疫组化笔划定抗体铺放区域，用4%的多聚甲醛在室温下固定1 min，利用PBS溶液清洗3次，洗后用0.5%吐温-20（Tween-20）在室温下处理1 min，加过氧化物酶阻断剂B，置于37 ℃恒温箱20 min，再用PBS溶液清洗5 min，用血清封闭，于37 ℃恒温箱孵育30 min，吸去血清孵育30 min，重复用PBS溶液清洗5 min，加ABC试剂于37 ℃孵育30 min，接着用PBS溶液清洗5 min，加过氧化物酶底物（DAB）室温孵育15 min，用自来水冲洗5 min，用苏木素染色，再用自来水冲洗15 min后，采用中性树胶封片，置于60 ℃烘片30 min；使用显微镜油镜观察，拍照。

2 结果与分析

2.1 采用HPLC测定茶样酯型儿茶素含量

酯型儿茶素包括EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）和ECG（表儿茶素没食子酸酯），不仅具有酚类化合物抗氧化的性质，还具有优于其他儿茶素的生物活性，如抗糖尿病、抗肿瘤等作用［11］。试验以5种不同的中小叶种茶为试样进行检测，结果如表1所示。5种茶样酯型儿茶素含量表现为十里香>桂绿1号>浙农113>福鼎大白茶>浙农139，其中，十里香的酯型儿茶素总含量最高，为0.509 g/100 g。

2.2 中性红染色法定位茶样液泡

中性红是低毒性、弱碱性pH指示剂，在弱碱性条件下，活细胞能够吸收中性红进入植物细胞液泡中，中性红在液泡中会呈现出深粉红色，而原生质体和细胞壁通常不着色。本试验选用0.1%中性红对茶样进行染色（图1），茶叶切片中分布有众多红色的圆形或椭圆形、大小不均一的物质，为茶叶的液泡。

2.3 茶样酯型儿茶素的亚细胞定位研究

选取十里香（图2A）、浙农113（图2B）、桂绿1号（图2C）、浙农139（图2D）、福鼎大白茶（图2E）5种中小叶种的茶芽切片进行免疫组织化学染色。如图2所示，在油镜（10×100）下观察，5种茶样内部剖面略有差别，但酯型儿茶素抗体结合部位均集中在大量的椭圆形亚细胞器中。与中性红染色后的液泡对比发现，5种茶样的酯型儿茶素亚细胞定位于液泡中。

3 讨论

酯型儿茶素是茶树中主要的次生代谢产物，占茶儿茶素总量的76%，具有抗氧化、抗癌、抗心血管疾病作用，其药理作用远强于非酯型儿茶素，是决定茶叶品质、加工方式及其功效的重要组分，也是当今药物开发的主要目标。迄今为止，酯型儿茶素的研究多数为大叶种茶，以中小叶种茶为研究对象的较少，但以大叶种茶闻名的云南省也有许多品质极佳的中小叶种茶。免疫组织化学法被常应用于生化研究中，利用抗原和抗体能够特异性结合的优势，能够直接定位细胞或者组织内小分子物质的特定表达，冷冻切片是常用的对样品进行免疫组织化学分析、原位杂交和空间转录组分析的固定方法，相较于石蜡包埋法，其优点在于可以有效保存细胞内的有机物质，不受外界试剂的刺激和温度的影响，组织回缩不明显，内部细胞形态改变较小，在本试验中更适合选用冷冻切片的方法对娇嫩脆弱的茶样进行包埋切片，应用免疫组织化学法对茶样中酯型儿茶素进行亚细胞定位，根据植物学组织形态进行判断，抗体结合位置与液泡位置重合度较高，说明茶树中酯型儿茶素在亚细胞水平上主要定位于液泡中。此研究结果可为中小叶种茶样酯型儿茶素的生物合成途径、生理学功能、选择育种提供理论基础，同时也可以为植物中代谢产物的亚细胞定位研究提供思路［12-19］。

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