防城金花茶叶片的生药学及UPLC指纹图谱

姚涵雅 盘涌 高慧 白燕远 李耀燕 闫国跃 谢阳姣

收稿日期：2022-11-14

基金项目：广西创新驱动发展专项资金项目（桂科AA18118049-7）；广西自然科学基金重点项目（2020GXNSFDA297029）； 2020年广西中药药效研究重点实验室运行补助项目（20-065-38）

作者简介：姚涵雅（1996-），女，河南驻马店人，在读硕士研究生，研究方向为民族药鉴定与资源开发研究，（电话）15688193875（电子信箱）3537802062@qq.com；通信作者，谢阳姣（1975-），女，湖南郴州人，研究员，博士，主要从事中药、民族药资源开发与利用研究，（电话）18172384560（电子信箱）xieyangjiao@163.com。

姚涵雅，盘 涌，高 慧，等. 防城金花茶叶片的生药学及UPLC指纹图谱［J］. 湖北农业科学，2024，63（5）：91-97，181．

摘要：采用性状鉴别和显微鉴别方法，观察防城金花茶（Camellia nitidissima var. phaeopubisperma）的原植物形态、组织结构、粉末特征；采用超高效液相色谱（UPLC）并运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统建立防城金花茶液相指纹图谱，运用SIMCA-P14.1软件对其化学成分进行主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析。性状鉴别结果显示，防城金花茶叶展开后呈椭圆形、长椭圆形、矩圆形或卵圆形，薄革质、两面均无毛，叶脉网状，边缘有细锯齿或锯齿。叶肉组织散有大型分枝状不规则石细胞和草酸钙簇晶；导管有环纹导管及螺纹导管，气孔不定式。超高液相指纹图谱显示，供试防城金花茶样本化学成分谱存在差异；基于化学成分差异，采用主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析可将防城金花茶样本分成2大类，维生素B6、去氧肾上腺素、芦丁、咖啡碱、金丝桃苷是区分2种指纹类型的主要标志性成分。

关键词：防城金花茶（Camellia nitidissima var. phaeopubisperma）；性状鉴别；显微鉴别；超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱；生药学

中图分类号：O657.63；TS272.7         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）05-0091-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.016            开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

The pharmacognosy and UPLC fingerprint of the leaves of Camellia nitidissima var. phaeopubisperma

YAO Han-ya1， PAN Yong1， GAO Hui1， BAI Yan-yuan1，2， LI Yao-yan1，2， YAN Guo-yue1，2， XIE Yang-jiao1，2

（1.School of Yao Medicine， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning  530200，China；

2.Guangxi Key Laboratory of Efficacy Study on Chinese Materia Medica， Nanning  530200，China）

Abstract： The plant morphology， tissue structure and powder characteristics of Camellia nitidissima var. phaeopubisperma were observed by means of character identification and microscopic identification. The liquid fingerprint of Camellia nitidissima var. phaeopubisperma was established by ultra high-performance liquid chromatography （UPLC） and similarity evaluation system of traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint. Principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis were performed on the chemical composition by SIMCA-P14.1 software. The results of character identification showed that Camellia nitidissima var. phaeopubisperma was elliptical， oblong， rectangular or oval， thin leathery， hairless on both sides， reticulated leaf veins and serrulate or serrate on the margins. In the mesophyll tissue were present large branching irregular stone cells and clusters of calcium oxalate crystals； the vessels were annular and spiral， and the stomata were anomocytic type. The HPLC fingerprints indicated differences in the chemical composition of the tested Camellia nitidissima var. phaeopubisperma samples. Based on these differences， the samples could be divided into two categories using principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis， with vitamin B6， phenylephrine， rutin， caffeine， and hyperoside being the key signature ingredients that distinguished the two types of fingerprints.

Key words： Camellia nitidissima var. phaeopubisperma； morphological identification； microscopic identification； ultra-high-performance liquid chromatography（UPLC） fingerprint； pharmacognosy

金花茶（Golden Camellia species）是山茶科山茶属金花茶组植物的统称，常绿灌木或小乔木，是山茶属中罕有的花色金黄的品种［1，2］，被誉为“植物界的大熊猫”和“茶族皇后”［3］。金花茶富含丰富的氨基酸、维生素、挥发油、黄酮、皂苷、多糖类营养成分及矿质元素等［4，5］。用于预防肿瘤、抗氧化、降血糖等［6-8］。金花茶叶全年均可采收，晒干即可入药，为广西壮族民间草药，习惯代茶饮，已有较长的历史［9］。明代医药学家李时珍在《本草纲目》中记载：“山茶嫩叶炸熟水淘可食，亦可蒸晒做饮［10］”。现全世界已发现的金花茶组植物有42个种5个变种［11］，其中分布和应用最为广泛的为防城金花茶（Camellia nitidissima var. phaeopubisperma），其叶被列为国家新资源食品。金花茶目前尚未被收载入《中华人民共和国药典》，广西将其作为壮药收入《广西壮族自治区壮药质量标准》（第二卷），但收载的具体种并无定论。金花茶组植物含多个种（变种），其形态和化学成分等在种间和种内均存在较大差异。研究发现金花茶组植物叶形变异较大，可用于金花茶组植物的简单鉴别，但因同种不同个体间变异亦十分明显，无法单独利用叶形区分不同种金花茶［12］。已有研究表明，根据金花茶组植物成熟叶表皮微形态特征差异可作为金花茶分类的重要依据［13，14］。梁霄等［15］采用薄层色谱法分别鉴别不同种金花茶叶中的齐墩果酸、芦丁和人参皂苷Rg1等化学成分。由于金花茶组植物的复杂性和多样性，金花茶植物种间鉴别困难，其形态特征及化学成分差异仍需进一步研究［16，17］。

本研究对防城金花茶叶片进行系统的生药学研究，并采用超高效液相色谱法对其进行指纹图谱研究，以期为超高效液相色谱的鉴定和质量评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料来源于广西防城港市东兴市冲峰金花茶种植基地，基地金花茶均由原南宁市金花茶公园基因库主管黄连冬高级园林工程师鉴定为正品。选取具有表型性状差异的防城金花茶原植物，每个表型选5株以上，共挂牌111株。观察表型性状并记录，根据试验需要，采集其新鲜叶片，为了便于后期粉末的观察试验，将采集到的样本用硅胶快速干燥后于-4 ℃保存备用；制作切片的样本用FAA固定液（10%甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70%乙醇90 mL）固定。

1.2 仪器

奥林巴斯生物显微镜（型号CX21FS1C），奥林巴斯中国有限公司；ZF-2二用紫外分析仪，上海安亭电子仪器厂；超高效液相色谱仪，美国Waters公司。

1.3 试剂

乙腈（色谱纯），磷酸（色谱纯），乙醇（分析纯），水（去离子水，自制）。咖啡碱（批号wkq19040910，含量98%）、丁香酸（批号wkq18061204，含量98%）、表儿茶素（批号wkq19010401，含量98%）、牡荆素（批号wkq19031111，含量98%）、金丝桃苷（批号wkq19040913，含量98%）、染料木苷（批号wkq19051702，含量98%）、杨梅素（批号529-44-2，含量98%）、槲皮苷（批号wkq19031304，含量98%），均购自四川省维克奇生物科技有限公司；芦丁（批号100080-201811，含量91.7%）、槲皮素（批号100081-201610，含量99.1%），均购自于中国食品药品鉴定研究院；木兰花碱（批号2141-09-5，含量98%）购自上海源叶生物科技有限公司；秦皮甲素（批号531-75-9，含量98%）、原儿茶醛（批号139-85-5，含量98%）、对香豆酸（批号501-98-4，含量98%）、维生素B6（批号65-23-6，含量99%）、去氧肾上腺素（批号59-42-7，含量98%）、阿魏酸（批号1135-24-6，含量98%）、鞣花酸（批号476-66-4，含量98%），均购自于成都埃法生物科技有限公司。

1.4 原植物形态

对防城金花茶叶片的植物形态、叶表面特征等进行观察。

1.5 显微鉴别

分别采用组织切片法和粉末制片法进行显微鉴别。

1.5.1 组织切片法 用流水将新鲜的金花茶洗净，选取正常完整的叶片，切成2～3 mm长的小段，将小段固定于FAA固定液中24 h，按常规石蜡制片法制作金花茶叶片组织切片，最后用番红-固绿进行染色，中性树胶封片，显微镜下观察并拍摄，记录结果。

1.5.2 粉末制片法 将防城金花茶叶片的粉末（过五号筛）分别置于载玻片上，滴加水合氯醛试液后在酒精灯上加热透化，稀甘油试液装片，置于显微镜下观察、拍照，记录粉末显微特征。

1.6 超高效液相色谱法

1.6.1 色谱条件 超高效液相色谱仪（包括Waters FIN样品管理器，QSM四元溶剂管理器，TUV Detector检测器，Empower色谱工作站）；色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。

色谱条件：流动相为乙腈和0.1%磷酸水溶液；柱温35 ℃，样品温25 ℃；进样量0.2 μL；流速0.2 mL/min；双通道，A通道波长320 nm，B通道波长210 nm，梯度洗脱条件见表1。方法学考察结果显示精密度、重现性、稳定性、加样回收率良好，相对标准偏差（RSD）均<0.05。

1.6.2 对照品溶液制备 对照品根据说明书采用相应的溶剂溶解后制成浓度约5 mg/mL的母液。用时将母液稀释成适当的进样浓度，其中维生素B6 0.132 mg/mL、去氧肾上腺素1.3 mg/mL、咖啡碱0.25 mg/mL、秦皮甲素0.019 2 mg/mL、原儿茶醛0.010 3 mg/mL、丁香酸0.329 mg/mL、表儿茶素0.136 mg/mL、木兰花碱0.055 mg/mL、对香豆酸0.007 6 mg/mL、阿魏酸0.009 6 mg/mL、鞣花酸0.04 mg/mL、牡荆素0.03 mg/mL、芦丁0.100 mg/mL、金丝桃苷0.100 mg/mL、染料木苷0.21 mg/mL、槲皮苷0.028 mg/mL、杨梅素0.022 mg/mL、槲皮素0.092 mg/mL。

1.6.3 供试品溶液的制备 精密称定防城金花茶叶粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇溶液10 mL，密塞，超声30 min，冷却，过滤。滤液用旋转蒸发仪蒸干，后用50%乙醇溶液10 mL溶解，摇匀，进样前用0.2 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

1.6.4 标准曲线制作 对照品均分别设0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μL，共7个进样梯度，测定峰面积，以每个进样梯度计算出的含量为横坐标，峰面积为纵坐标，制作线性回归方程，测得各对照品线性范围。对照品线性回归方程r2>0.999，表明标准曲线线性关系良好（表2）。

2 结果与分析

2.1 防城金花茶叶片的植物形态

防城金花茶为常绿灌木或小乔木，高3～4 m；嫩枝圆柱形，淡紫红色，老枝黄褐色，无毛。嫩叶蓝灰色，无毛；老叶上面深绿色，下面浅绿色，薄革质，两面均无毛；叶完整展平后呈椭圆形（长宽比<2.5，叶基下延）、长椭圆形（长宽比≥2.5，叶基下延）、矩圆形（叶基圆钝）或卵圆形（基部较宽，向尖端渐变窄）；叶脉网状，网脉上面明显，边缘有细锯齿或锯齿；叶柄长0.5～1.0 cm，绿色，无毛。花单生于叶腋，花开时呈杯状、壶状或碗状，花蕾黄绿色，花冠顶部有3个棕色小点，花展开时小棕点撕裂；花瓣8～15片，蜡质，金黄色，花径2.0～4.5 cm，无毛，基部托以缩存的萼片和苞片；花萼青色或青褐色，萼片数5片；蒴果扁球形，棕褐色（图1）。

2.2 防城金花茶叶的显微特征

2.2.1 组织切片 叶组织结构：叶横切面上表皮细胞较大，呈近长方形，下表皮细胞较小，呈椭圆形；叶肉组织分布在上、下表皮之间，栅栏组织和海绵组织分化明显，栅栏组织在叶片内排列成2层，草酸钙簇晶散在；海绵组织细胞形状不规则，排列疏松，细胞间隙较大，散有大型分枝状石细胞和草酸钙簇晶；主脉维管束为无限外韧型，呈U形，上下侧被厚壁组织包围，韧皮部和木质部分层明显，木质部细胞排列紧密，导管分布较多（图2）。

2.2.2 粉末制片 防城金花茶叶粉末为灰绿色，其粉末显微特征如图3所示。导管有环纹导管及螺纹导管（图3A和图3B），叶表皮碎片，表皮细胞垂周壁波状弯曲，气孔不定式（图3C），石细胞不规则，呈分枝状，细胞壁较厚（图3D、图3E和图3F），纤维成束排列，细胞壁厚（图3G），棕色物质呈块存在（图3H），草酸钙簇晶数目较多（图3I和图3J）。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取样品粉末按“1.6.3”的方法制备供试品溶液，按“1.6.1”的色谱条件测定，连续进样6次，以维生素B6为参照峰，记录各峰的保留时间和峰面积，计算各共有峰相对保留时间，其RSD均小于1%，相对峰面积RSD均小于5%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 按“1.6.3”的方法，对同一批样品粉末同时制备6份供试品溶液，按“1.6.1”的色谱条件测定，记录各色谱峰的峰面积，计算各峰面积的RSD。测得所有RSD均小于2.00%，说明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取样品粉末按“1.6.3”的方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h和24 h进样测定，记录各峰的保留时间和峰面积。计算各峰面积的RSD。测得RSD均小于2.00%，表明建立的UPLC方法稳定性良好。

2.4 UPLC指纹图谱特征

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012）”建立防城金花茶UPLC指纹图谱。各株系进行相似度检验，相似度检验结果大于0.9视为同一指纹类型，经检验，受试111株防城金花茶有3个指纹类型（图4和图5，JHCFP1至JHCFP3），其中，JHCFP1号类型包含13株，特征为在13～22 min处出峰较多；JHCFP2号有94株，其特征为在12 min处有一特征峰，27 min处各有一峰面积较高的化学成分；JHCFP3号仅有1株，特征为在4～9 min处出峰较多，且峰面积较高。FP1-10、FP1-24及FP1-26这3株指纹类型不稳定。各指纹类型色谱峰数量和峰面积均存在一定的差异，表明防城金花茶种内存在一定的变异，不能采用单一一种UPLC指纹图谱进行鉴别。各指纹类型所含株系见表3。

2.5 防城金花茶叶片中的化学成分

从所试111株样品中检测到50多种化学成分，其中已知化学成分18种（图4和图5），根据回归方程计算防城金花茶叶片中已知化学成分含量，各成分含量信息见表4。JHCFP1号类型中有15种化学成分含量最小值为0，JHCFP2号类型中有16种化学成分含量最小值为0，表明并不是所有株系均含有其化学成分；根据最大值和平均值可知，防城金花茶含量较高的成分有咖啡碱、表儿茶素、木兰花碱、杨梅素。JHCFP1号中维生素B6、秦皮甲素、丁香酸和鞣花酸含量较高。JHCFP2号中原儿茶醛和芦丁含量较高。因JHCFP3号仅有1株，不具有代表性，未做统计。

2.6 防城金花茶叶片化学模式识别分析

2.6.1 主成分分析 因JHCFP3号仅有1株，不具有代表性，故采用SIMCA-P 14.1软件对其他107株防城金花茶样品指纹图谱中18个共有峰峰面积进行主成分分析（Principle component analysis，PCA），以特征值≥1及累积方差贡献率为依据，共得到5个主成分，其累计方差贡献率为73.4%，提取出的5个主成分能够概括107株防城金花茶叶片中大部分信息。107株防城金花茶分为2类，JHCFP1号指纹类型集中在第四象限，JHCFP2号指纹类型集中在第一、第三象限（图6）。

2.6.2 正交偏最小二乘法-判别分析 依据PCA结果，对107株防城金花茶样品进行正交偏最小二乘法-判别分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。OPLS-DA模型，R2X=0.592，R2Y=0.821，Q2=0.910，均大于0.5，说明模型稳定可靠。同时，200次内部交叉验证模型主要参数Q2=-0.254，R2=0.058 3，说明OPLS-DA模型不存在过拟合现象。2种防城金花茶指纹类型完全被分开，相互之间没有出现样品交叉的情况，且全部样品均位于95%可信区间之内（图7a、图7b）。对110株防城金花茶样品分层凝聚聚类（Hierarchical agglomerative clustering，HAC），2种防城金花茶指纹类型自下而上各聚为一类（图7c）。采用变量重要性投影值（Variable importance in project，VIP）筛选造成防城金花茶样品差异性的标志物，其中VIP大于1的成分包括5个，分别为维生素B6、去氧肾上腺素、芦丁、咖啡碱、金丝桃苷，这些成分是造成2种防城金花茶指纹类型差异的主要标志性成分，其余峰VIP小于1，对区分样品影响较小（图7d）。

3 小结与讨论

全世界已发现的金花茶组植物有42个种5个变种［11］，广西壮药质量标准第二卷对金花茶的质量标准进行了规定，其中来源规定为“山茶科植物金花茶Camellia petelotii （Merrill） Sealy 的干燥叶”，从其生物性状描述来看，应包含金花茶组里的防城金花茶、显脉金花茶（Camellia euphlebia Merr.et Sealy）等多个种（变种），可见该质量标准未对具体种进行规定。

该标准规定金花茶含量测定指标成分为山柰素（C15H10O6），相关文献认为山柰酚和山柰素分别是两种黄酮化合物的中文名称，属同一类黄酮醇类天然化合物，其中山奈酚为kaempferol（ CASNo. 520-18-3，C15H10O6，MW286.24），山柰素为kaempferide（kaempferol 4′-methyl ether，CAS No.491-54-3，C16H12O6，MW300.26），山柰素是山奈酚的4′-甲醚化物［18］。从《广西壮族自治区壮药质量标准》（第二卷）来看，该标准中的指标成分为山柰素（C16H12O6）。本研究对金花茶进行液相指纹图谱和质谱分析也发现，多数金花茶种含有山奈酚，但并未发现山柰素。而本研究对防城金花茶质谱分析结果显示有山奈酚，但液相指纹中2种成分均未检测到，推测可能是含量过低，试验设置的液相条件无法检测到该成分。

本研究分别从性状、显微鉴别和含量测定三方面对防城金花茶进行研究，发现防城金花茶叶中草酸钙簇晶较多，方晶较少，这与《广西壮族自治区壮药质量标准》第二卷记载的金花茶叶鉴定结果一致。不同指纹类型的防城金花茶叶中化学成分组成及含量存在一定差异，这一研究结果与主成分分析结果较为相似，从而进一步论证了化学模式识别技术可用于鉴别防城金花茶。本研究由于试验条件有限，未能检测出防城金花茶叶含有的所有化学成分。通过优化液相色谱条件，检测到防城金花茶叶中50多种化学成分，包括多酚类、黄酮类等，其中黄酮类成分较多，与莫润宏等［19］、李辛雷等［20］的研究结果一致。

防城金花茶为金花茶组植物里的1个种，其生物性状与其他金花茶种具有共同之处，也存在显著差异性状。采用单一的鉴别方法难以对金花茶组植物进行鉴别，因此，对防城金花茶进行鉴别时，可先通过形态、性状、显微特征进行初步判断，再进一步结合超高效液相色谱法结果进行综合判定。

参考文献：

［1］ 黄兴贤，邹 蓉，胡兴华，等.十四种金花茶组植物叶总黄酮含量比较［J］.广西植物，2011，31（2）：281-284.

［2］ 柴胜丰，韦 霄，蒋运生，等.濒危植物金花茶开花物候和生殖构件特征［J］.热带亚热带植物学报，2009，17（1）：5-11.

［3］ 曹 芬，樊兰兰.金花茶研究进展［J］.中国药业，2013，22（4）：95-96.

［4］ 陈 瑶，龚苏晓，徐 旭，等.金花茶化学成分和药理作用研究进展［J］.药物评价研究，2022，45（3）：575-582.

［5］ 陈雪梅，林 玮，玄祖迎，等.7种金花茶组植物叶片营养成分分析［J］.亚热带植物科学，2021，50（3）：170-174.

［6］ 王梓灵，郭瑜婕，朱芸芸，等.金花茶有效部位抑制表皮生长因子受体（EGFR）抗非小细胞肺癌的作用机制研究［J］.中国中药杂志，2021，46（20）：5362-5371.

［7］ 韦 霄，黄兴贤，蒋运生，等.3种金花茶组植物提取物的抗氧化活性比较［J］.中国中药杂志，2011，36（5）：639-641.

［8］ ZHANG H L，WU Q X，QIN？X M. Camellia nitidissima Chi flower extracts inhibit α-amylase and α-glucosidase： Invitro by analysis of optimization of addition methods， inhibitory kinetics and mechanisms［J］.Process Biochem，2019，86：177-185.

［9］ 广西壮族自治区食品药品监督管理局，广西壮族自治区食品药品检验所.《广西壮族自治区壮药质量标准 第2卷 2011年版》注释 下［M］.南宁：广西科学技术出版社，2013.

［10］ 李时珍.本草纲目［M］.朱 斐，译.南昌：二十一世纪出版社，2014.

［11］ 莫杰姝，曾 进，甘春雁，等.金花茶遗传多样性研究进展［J］.安徽农业科学，2015，43（10）：34-37，39.

［12］ 陈春如，谢佩吾，邹家通，等.12种金花茶组植物叶片的比较形态学研究［J］.林业与环境科学，2019，35（6）：7-15.

［13］ 朱栗琼，覃冬梅，招礼军，等.6种野生金花茶叶表皮微形态特征及其系统学意义［J］.植物研究，2021，41（6）：841-850.

［14］ 覃冬梅，朱栗琼，邓斌胜，等.五种金花茶叶片表皮显微形态特征比较及分类研究［J］.南宁师范大学学报（自然科学版），2020，37（1）：91-96.

［15］ 梁 霄，莫建光，刘布鸣，等.三种金花茶叶的薄层色谱鉴别研究［J］.中国民族民间医药，2014，23（21）：8-9.

［16］ 陈 莹，郭蓓琳，姚丽敏，等.基于DNA条形码进行金花茶组种间鉴别［J］.种子，2021，40（2）：139-142.

［17］ 秦小明，宁恩创，李建强.金花茶食品新资源的开发利用［J］.广西热带农业，2005（2）：20-22.

［18］ 张永文，唐 溱，赵晓霞.对山柰酚与山柰素中文名称的辨正及其在有关药品标准中的正确使用［J］.中国药品标准，2019，20（3）：201-204.

［19］ 莫润宏，王 蕤，姜丽娜，等.高效液相色谱法同时测定金花茶中12种黄酮类成分［J］.分析试验室，2020，39（10）：1165-1169.

［20］ 李辛雷，王佳童，孙振元，等.金花茶花朵和叶片UPLC-QTOF-MS分析［J］.林业科学研究，2018，31（6）：83-88.