HPLC法测定碱水粑中的脱氢乙酸

程晓芳 邹贵香 周宁菱 刘思萌 黄永芳 冯超义

摘 要：建立一种快速检测碱水粑中脱氢乙酸含量的高效液相色谱方法。方法：称取5 g样品，经10%乙醇溶液提取、硫酸锌溶液+氢氧化钠溶液沉淀蛋白质，定容至25 mL，高速离心后取上层清液过滤膜，经高效液相色谱仪在293 nm检测波长下进行检测。结果：脱氢乙酸浓度在1.00～200.00 μg·mL-1时与峰面积呈现良好的线性关系，相关系数R2=0.999 8；方法检出限为0.001 3 g·kg-1，定量限为0.004 g·kg-1；经方法学验证结果表明，加标回收率为92.42%～98.65%，相对标准偏差为1.32%～2.50%。结论：本方法能够快速且准确地检测出碱水粑中脱氢乙酸的含量，适合在基层检验检测机构推广普及，具有一定的实际应用价值。

关键词：高效液相色谱法；脱氢乙酸；碱水粑

Determination of Dehydroacetic Acid in Alkaline Water Cake by HPLC

CHENG Xiaofang1， ZOU Guixiang2， ZHOU Ningling1， LIU Simeng1， HUANG Yongfang1， FENG Chaoyi1

（1.Jingdezhen Market and Quality Supervision and Management Comprehensive Inspection and Testing Center， Jingdezhen 333000， China; 2.Ganzhou Shangyou County Military Grain Supply Station， Ganzhou 341200，China）

Abstract： A high performance liquid chromatography method for dehydroacetic acid in alkaline water was established. Method： 5 g of samples were weighed， extracted by 10% ethanol solution， zinc sulfate solution+sodium hydroxide solution， and settled to 25 mL. After centrifugation， the supernatwas filtered and tested at 293 nm by high-performance liquid chromatography. Result： Dehydroacetic acid concentration was from 1.00 to 200.00 μg·mL-1， the correlation coefficient R2=0.999 8， the detection limit of the method was 0.001 3 g·kg-1， the quantification limit was 0.004 g·kg-1; the recovery rate was 92.42%～98.65% and relative standard deviation  was 1.32%～2.50%. Conclusion： This method can quickly and accurately detect the content of dehydroacetic acid in the alkaline water cake， which is suitable for the popularization in the basic inspection and testing institutions， and has certain practical application value.

Keywords： high performance liquid chromatography; dehydroacetic acid; alkali water cake

碱水粑又称“灰水糕”“灰水果”，是江西景德镇市的一种本土特色美食，由大米磨浆后加入碱水，通过特制的粑筛猛火蒸煮而成，厚度一般10 cm左右[1]。随着景德镇市旅游业的发展，碱水粑这一传统美食也受到了越来越多外地旅客的欢迎，其生产需求量也日益增大。许多不法商贩为延长碱水粑的保质期，常会在生产加工环节加入过量的防腐剂，特别是脱氢乙酸。脱氢乙酸（Dehydroacetic Acid，DHA）又称脱氢醋酸，常温下呈白色或淡黄色的结晶性粉末，不易溶于水，易溶于碱性溶液，是一种低毒高效的新型防腐、防霉剂，其抑菌的效果基本不受食品酸碱度的影响，对霉菌、酵母菌等真菌以及细菌等微生物的生长有显著的抑制作用[2-5]。人体若摄入过多的DHA则会对健康产生一定危害，可能会出现肠胃不适、代谢紊乱、过敏反应等一系列副作用[6]。因此，准确且快速地检测食品中DHA的含量对DHA这一防腐剂的使用管控具有非常重要的意义。

目前，测定DHA含量的方法主要有液相色谱法、气相色谱法、气相色谱串联质谱法以及液相色谱串联质谱法等[7-11]，参照《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）中的前处理方法，本文对国标方法中提取剂、蛋白沉淀剂、流动相及流动相比例等条件进行优化，以提高检验检测效率，以期建立一种快速、准确测定碱水粑中脱氢乙酸含量的检测方法，为更多基层检验检测机构测定碱水粑中脱氢乙酸含量提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验样品：碱水粑，购自景德镇市本地市场。试剂：脱氢乙酸标准品，含量100 mg，纯度99.9%，坛墨质检科技股份有限公司；甲醇、乙腈，色谱纯，上海捷世凯生物科技有限公司；乙酸铵、硫酸锌、氢氧化钠，分析纯，西陇科学股份有限公司；无水乙醇，分析纯，镇江久亿化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters Arc HPLC液相色谱仪，配置2998二极管阵列检测器；ChromCore C18-AC色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；超纯水机（Millipore EXPRESS40）；

万分之一电子天平（PX-224ZH/E）；十万分之一电子天平（CPA225D）；台式离心机（DT45H），湖南可成仪器设备有限公司；多管涡旋仪（KN-026S），北京科德诺思技术有限公司；数控超声波清洗器（KQ-500DE），昆山市超声仪器有限公司（舒美）。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

乙酸铵溶液（0.02 mol·L-1）：称取1.54 g乙酸铵，溶于水并稀释至1 L；氢氧化钠溶液（20 g·L-1）：称取20 g氢氧化钠，溶于水并稀释至1 L；硫酸锌溶液（120 g·L-1）：称取120 g硫酸锌，溶于水并稀释至1 L；乙醇溶液（10%）：50 mL无水乙醇用水稀释至500 mL。

1.3.2 建立标准工作曲线

准确称取脱氢乙酸标准品50.05 mg于50 mL容量瓶中，用10 mL的NaOH溶液溶解，加水定容得到DHA标准储备溶液（1.0 mg·mL-1）。分别吸取DHA标准储备溶液0.10 mL、1.00 mL、5.00 mL、10.00 mL和20.00 mL于100 mL容量瓶中，加水定容。配制成浓度为1.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、50.0 μg·mL-1、100.0 μg·mL-1和200.0 μg·mL-1标准工作液。

1.3.3 液相色谱条件

本实验选择ChromCore C18-AC色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇+0.02mol·L-1乙酸铵（体积比为10∶90，）；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长：293 nm；柱温：30 ℃。

1.3.4 样品前处理

称取粉碎、均质后的样品约5 g（精确至0.001 g），置于50 mL离心管中，加入10 mL乙醇溶液（10%）、5 mL硫酸锌溶液（120 g·L-1）、1 mL氢氧化钠溶液

（20 g·L-1），涡旋振摇5 min，加水稀释至25 mL刻度线，4 000 r·min-1离心5 min。取上清液过0.45 ?m水相滤膜，供高效液相色谱测定。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

选用甲醇+0.02 mol·L-1乙酸铵溶液、乙腈+0.02 mol·L-1乙酸铵溶液、甲醇+水以及乙腈+水4种流动相进行比较。结果发现使用乙腈+水和甲醇+水这两种流动相时，脱氢乙酸的峰型拖尾十分严重，保留时间过长，分离效果并不理想；而甲醇+0.02 mol·L-1乙酸铵溶液和乙腈+0.02 mol·L-1乙酸铵溶液作为流动相时脱氢乙酸峰型对称性较好，拖尾现象得到明显改善，出峰时间也较为合适，同时考虑到甲醇与乙腈相比价格更加实惠，故最终选择甲醇+0.02 mol·L-1乙酸铵溶液作为流动相，以降低基层检验检测机构的检测成本。

2.2 流动相比例的选择

在脱氢乙酸经高效液相色谱测定分析过程中发现，流动相中甲醇的比例对脱氢乙酸峰型及保留的时间长短影响很大，若色谱峰分离的效果不好、拖尾的现象严重就会导致最终测定含量的不准确。因此，比较了不同流动相比例（甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸铵溶液=5∶95、甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸铵溶液=10∶90、甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸铵溶液=15∶85）的脱氢乙酸的色谱图，详见图1。结果发现当流动相中甲醇比例为5%时，脱氢乙酸出峰时间为9.213 min，峰型存在明显的拖尾，保留时间将近3 min；当流动相中甲醇比例为10%时，脱氢乙酸出峰时间提前至7.568 min，保留时间也大大缩短，峰型拖尾现象得到明显改善，对称性较好；当流动相中甲醇比例为15%时，脱氢乙酸出峰时间为

5.725 min，保留时间缩短至1 min左右，峰型对称性与流动相中甲醇比例为10%时差不多，考虑到出峰时间过早可能会导致样品中杂质分离效果不理想，因此，为了保证结果的准确性，同时提高基层检验检测效率，最终选择流动相比例为甲醇+0.02 mol·L-1乙酸铵=10∶90进行脱氢乙酸含量测定分析。

2.3 蛋白沉淀剂的选择

由于碱水粑中含有丰富的蛋白质，因此在前处理过程中必须进行蛋白质沉淀，常见的蛋白沉淀剂有乙酸锌、亚铁氰化钾、氢氧化钠和硫酸锌，本实验对3种不同蛋白沉淀组合剂（亚铁氰化钾+乙酸锌、亚铁氰化钾+硫酸锌、氢氧化钠+硫酸锌）回收率情况进行比较。由表1可知，氢氧化钠+硫酸锌组合作为测定蛋白沉淀剂时回收率最高，同时考虑到脱氢乙酸易溶于碱性溶液，且配制脱氢乙酸标准品时也需用氢氧化钠溶液进行溶解，故最终决定选用氢氧化钠+硫酸锌作为本次实验的蛋白沉淀剂。

2.4 提取剂的选择

本实验选择水、乙醇、甲醇、10%乙醇溶液和10%甲醇溶液这5种溶液分别作为提取剂提取样品中的脱氢乙酸。2种不同加标浓度（0.05 g·kg-1和

0.50 g·kg-1）的样品经5种提取剂提取后回收率结果见表2，结果发现10%乙醇溶液提取的脱氢乙酸回收率最高，故最终选择10%乙醇溶液作为提取剂。

2.5 方法学验证结果

2.5.1 脱氢乙酸线性范围

将1.3.2配制的系列标准工作液按1.3.3色谱条件进行测定，以脱氢乙酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，如图2所示。结果显示脱氢乙酸浓度在1.0～200.0 μg·mL-1时，线性关系良好，回归方程为y=20 289x+12 291，相关系数R2=0.999 8。

2.5.2 检出限、定量限

以S/N=3计算检出限，S/N=10计算定量限，当取样量为5 g时，脱氢乙酸最低检出限为0.001 3 g·kg-1，定量限为0.004 g·kg-1。优于《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》（GB 5009.121—2016）中对检出限和定量限的要求。

2.5.3 方法回收率、精密度

以空白碱水粑为基底，按0.05 g·kg-1，0.25 g·kg-1，0.50 g·kg-1共3个水平加入标准溶液，每个加标水平平行测定6次，计算脱氢乙酸回收率及相对标准偏差值。由表3可知，在本研究条件下碱水粑中脱氢乙酸的加标回收率为92.42%～98.65%，相对标准偏差为1.32%～2.50%，结果符合相关标准要求，因此，本研究方法满足日常对碱水粑中脱氢乙酸含量的测定。

3 结论

本研究探讨了检测碱水粑中脱氢乙酸含量的方法。实验表明，选择甲醇+0.02 mol·L-1乙酸铵溶液作为流动相，且甲醇+0.02 mol·L-1乙酸铵=10∶90时，脱氢乙酸峰型对称性最好，拖尾现象得到改善；氢氧化钠+硫酸锌作为蛋白沉淀剂，10%乙醇溶液作为提取剂时，碱水粑中脱氢乙酸含量测定的回收率最高，确保了检测结果的准确性。以空白碱水粑作为底物，添加不同浓度水平脱氢乙酸做方法学验证，得到的回收率和相对标准偏差结果都符合标准要求。综上所述，本文建立的高效液相色谱测定碱水粑中的脱氢乙酸含量的方法具有操作简便、准确度高、重现性较好，适合在基层检验检测机构推广普及，具有一定的实际应用价值。

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