结核斑点试验联合血浆结核分枝杆菌游离DNA检测在肺结核中的诊断价值

吕燕燕

【摘要】 目的 分析结核斑点试验联合血浆结核分枝杆菌游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）检测肺结核的效能。方法 选取2019年1月—2022年6月都昌县第二人民医院诊治的80例疑似肺结核患者，对所有患者施以结核斑点试验、血浆MTB-cfDNA检测，以痰结核分歧杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）培养结果为“金标准”，统计对比不同检查方法在肺结核中的诊断效能。结果 80例疑似肺结核患者经痰MTB培养检查，共检出73例肺结核，结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测，共检出70例，结核斑点试验共检出62例，血浆MTB-cfDNA检测共检出52例。结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测肺结核的检出灵敏度、准确度分别为94.52%、93.75%，高于结核斑点试验的82.19%、81.25%，高于血浆MTB-cfDNA检测的69.86%、71.25%，差异有统计学意义（P<0.05）。Kappa检验显示，结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测结果与“金标准”检测结果的一致性较为理想（Kappa值=0.672，P<0.001）。结论 结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测在肺结核的诊断中效果显著，具有较高的疾病检出精准度，可为临床提供可靠的参考信息，临床应用价值较高，值得大力推行。

【关键词】 肺结核；结核分枝杆菌；结核斑点试验；诊断效能；灵敏度；准确度

文章编号：1672-1721（2024）16-0067-03     文献标志码：A     中国图书分类号：R446

肺结核是一种由结核分歧杆菌（MTB）感染而诱发的呼吸系统传染病，临床发生率处于较高水平。肺结核病灶主要在肺组织、器官、支气管与胸膜处。在我国传染类疾病中，肺结核发病与死亡数均高居第2位，对群众身心健康造成威胁[1-2]。近些年，由于人们生活方式转变，该病患病率呈逐年上升趋势[3-4]。早期及时诊断肺结核，并指导临床施行针对性的治疗措施，对于保障患者身心健康和改善其预后至关重要。既往临床多采用痰MTB培养对肺结核行诊断，但该方法检测耗费时间较长，不适合大范围开展早期筛查[5-6]。探索一种更为快速、有效的诊断措施成为临床研究的重点。近些年，随着医学技术的快速发展，结核斑点试验、血浆结核分枝杆菌游离DNA（cfDNA）等检测手段在肺结核的检查中广泛使用，取得了一定效果，但临床关于两者联合诊断肺结核的报道较为缺乏。基于此，本研究以80例疑似肺结核患者为研究对象，分析结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测在肺结核中的鉴别效果，为临床早诊断、早治疗提供可靠的参考依据，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月—2022年6月都昌县第二人民医院诊治的80例疑似肺结核患者为研究对象。患者中男性43例，女性37例；年龄35～78岁，平均年龄（60.53±2.48）岁；基础疾病，23例冠心病，26例糖尿病，18例高血压；体质量指数18.3～27.1 kg/m2，平均体质量指数（25.26±0.49）kg/m2。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

纳入标准：伴有咳嗽、咳痰持续2周以上；患者具有较高的依从性；患者对本试验知悉，且自愿签署知情同意书。

排除标准：存在恶性肿瘤者；意识障碍，难以正常交流者；合并精神疾病者；存有全身性感染者；合并免疫系统、凝血功能异常者；存在严重的脑器质性疾病者；存有严重的脏器损伤者；合并酒精、药物依赖史者；存在血液系统疾病者；伴有严重心力衰竭者。

1.2 方法

标本采集。患者入院后，于次日清晨采集全部患者的晨起空腹10 mL静脉血，置于无菌试管内，留存待检，分别用于血浆MTB-cfDNA检测与结核斑点试验。在标本采集时，需严格遵照无菌操作原则。

血浆MTB-cfDNA检测。5 mL血液标本经3 000 r/min离心处理10 min获取上层清液，采集2 mL上层清液转换至新离心管后；用12 000 r/min离心处理10 min，采集2 mL上清液到新试管中；行MTB的cfDNA提取，提取后再留存待检；以荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）开展测定，反应序列为95 ℃ 2 min预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s扩增反应，60 ℃下进行荧光信号收集，共反复进行40个循环，50 ℃ 30s冷却；获得扩增产物后经由3%琼脂糖凝胶电泳检测，进行核酸序列测定。

结核斑点试验。将采集的血样经肝素抗凝后取5 mL放入Ficoll淋巴细胞分离液，经过离心处理之后对外周血单个单核细胞予以分离，以细胞培养基重悬细胞，培养板每组条孔加入细胞培养基（50 μL）作为空白对照，植物血凝素（50 μL）作为阳性对照，刺激源为MTB特异性ESAT-6（50 μL）、LCEF-10抗原（50 μL）；之后于每孔分别加入LPBMC悬液（100 μL）；以上操作完毕后把培养板放在37 ℃条件下培养16～20 h，培养完毕后经蒸馏水对培养板进行洗涤，加入二抗体并在2～80 ℃环境下孵育1 h；孵育完毕后对培养板再次洗涤并加入50 μL显色液，在室温下放置7 min后洗涤，待干燥后计数斑点。

血浆MTB-cfDNA检测判断标准。紫外灯下检查，在254 bp有清晰的扩增条带，则判定为结核杆菌DNA阳性。

结核斑点试验判断标准。阴性对照斑点数>5，抗原A、B斑点与阴性对照组斑点数相比处于更高水平，超出阴性对照组斑点数的2倍。

所有的检测操作均由医院2名高年资的检验师医师共同检测，讨论得出最终检出结果，以保障检测结果的精准性。

1.3 观察指标

比较不同检查方法检查肺结核的诊断效能。以痰MTB培养结果为“金标准”，统计对比结核斑点试验、血浆MTB-cfDNA检测、结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测肺结核的检出情况。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件分析数据，计量资料以x±s表示，采用t检验，计数资料以百分比表示，采用χ2检验；一致性采用Kappa检验（Kappa值>0.75提示一致性极好，Kappa值为0.40～0.75提示一致性较为理想，Kappa值<0.40提示一致性差）；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

80例疑似肺结核患者，经痰MTB培养检查共检出73例肺结核，结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测共检出70例，结核斑点试验共检出62例，血浆MTB-cfDNA检测共检出52例，见表1。

结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测肺结核的检出灵敏度、准确度高于结核斑点试验、血浆MTB-cfDNA检测，差异有统计学意义（P<0.05）；3种检查方法的特异度、阳性预测值、阴性预测值比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

Kappa检验显示，结核斑点试验联合血浆MTB-

cfDNA检测结果与“金标准”检测结果的一致性较为理想（Kappa值=0.672，P<0.001）。

3 讨论

肺结核具有较高的患病率，是威胁人类健康的传染性疾病。糖尿病患者、尘肺患者、免疫抑制剂使用者等均为肺结核的易感人群。肺结核主要传播途径为经呼吸道飞沫传播。当肺结核患者咳嗽、打喷嚏、大笑与唱歌时，可将含有MTB的微滴从呼吸道播散到空气中并停留数小时，若被他人吸收将会引起感染。肺结核活动性感染者在1年内可引起超过20例新发感染，传染性极强，而20%的感染患者患病早期症状缺乏特异性[7-8]。患者在患病初期无明显特征，诊断比较困难，误诊率较高，易错过最优良的治疗时机，加重传染现象，增加社会压力[9]。因此，对肺结核做到早诊断、早治疗至关重要。

痰MTB培养为目前临床诊断肺结核的“金标准”，

但药敏试验耗时较长，得到准确结果至少需4周，且操作较为复杂，重复性差，在实际应用中受限[10]，需寻求更为快速有效的诊断措施。cfDNA属于一类广泛存在于生物体液中无细胞形态的胞外DNA片段，此游离DNA片段的测定目前已在产妇的产前诊断与肿瘤等病症的鉴别诊断内取得显著成效。因PCR技术问世，血浆MTB-cfDNA被大范围使用，尤其是荧光定量PCR在临床推行，能够以体外扩增法测定血浆MTB内存有的cfDNA，从而迅速、精准测定MTB，早期诊断出肺结核。如果实验室中血液收集、保存和运送等环节操作不当，会导致不稳定的cfDNA出现降解，而被降解的DNA分泌同样会对检测结果构成较多干扰，导致血浆MTB-cfDNA检测存在一定的漏诊、误诊风险。结核斑点试验运用酶联免疫吸附技术原理，由单细胞水平对细胞因子开展测定，为细胞免疫学措施之一。患者感染结核后，机体中会长时间存在抗原特异性的记忆性T细胞。结核斑点试验依照此类淋巴细胞遭受刺激释放的干扰素对感染进行判断，故具有较高的灵敏度。结核斑点试验具有检测标本易于获取的特点，在临床应用中较为便捷。结核斑点试验不受病例排菌类别、排菌量与是否排菌等因素的干扰，能够明显减少肺结核漏诊的情况[11-12]。需注意的是，细胞环境、机体内环境等因素均可能对该方法检测结果造成一定的影响，故临床多考虑行联合检测。本研究结果显示，80例疑似肺结核患者中，经痰MTB培养检查共检出73例，结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测共检出70例，结核斑点试验共检出62例，血浆MTB-cfDNA检测共检出52例。结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测肺结核的检出灵敏度、准确度分别为94.52%、93.75%，高于结核斑点试验的82.19%、81.25%，高于血浆MTB-cfDNA检测的69.86%、71.25%。Kappa检验显示，结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测结果与“金标准”检测结果的一致性较为理想。上述研究结果表明，结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测肺结核具有较高的诊断效能，可提高疾病的早期检出精准率。联合检测可起到优势互补功效，从不同层面对疑似肺结核患者机体内MTB检测，可最大程度减少漏诊、误诊情况发生。

综上所述，结核斑点试验联合血浆MTB-cfDNA检测在肺结核诊断中效能显著，具有较高的检出准确度，临床应用价值较高，值得大力推行。各医疗机构检验室可在自身条件允许的情况下，积极行结核斑点试验与血浆MTB-cfDNA联合检测，提高疾病检出精准性，为临床提供更多的参考，进而施行更规范且个体化的治疗措施，保障患者获得优良的预后。

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