利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法在结核病中的应用

辛宝林　于秀坤

【摘要】 目的 探讨利福平和异烟肼耐药基因突变采用PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法的应用价值。方法 88份送检的结核病患者临床标本， 得结核分枝杆菌分离株64株， 采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法进行检测， 同时采用比例法检测， 并以比例法为标准评价快速检测方法的诊断价值。结果 快速检测方法中对利福平耐药24份， 仅对异烟肼耐药24份， 对利福平和异烟肼均耐药22份， 不耐药18份。以耐药不耐药作为分割点， 比例法药敏试验结果为参考标准， 快速检测方法的灵敏度100.0%， 特异度90.0%， 准确度97.7%；两种检验方法一致性好（P>0.05）。结论 PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法可在12 h内对利福平和异烟肼耐药基因突变的作出判断， 与比例法药敏试验一致性好， 可信度高， 值得临床推广。

【关键词】 利福平；异烟肼；耐药；基因突变；结核分枝杆菌；快速检测

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.09.115

利福平和异烟肼是结核病的最重要的一线抗结核药物[1]。近年来结核分枝杆菌基因突变发生耐药的情况也时有发生， 世界卫生组织报道每年有新增48.9万例耐多药结核病， 其总量占结核病患者的4.8%， 而在我国则更为严重。耐多药结核病的早期确诊有利于患者的病情控制， 比例法药敏试验虽然结果可靠， 且被公认为判断结核分枝杆菌耐药的金标准， 但该方法需要细菌培养， 耗时2～4个月， 易贻误病情。随着分子生物学的飞速发展， 为结核分枝杆菌耐药性快速检测提供可能。本中心采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法对送检的疑似耐药结核病患者临床标本进行检测， 并将结果与比例法药敏试验进行分析， 现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 取2013年10月～2015年5月送检的疑似耐药结核病患者临床标本88份， 其中痰65份， 肺泡灌洗23份。

1. 2 去污染处理 将1～2倍于痰及肺泡灌洗液样本的4%NaOH放置于样本中， 震荡混匀， 静置20 min， 再将pH=6.8的磷酸缓冲液加入样本中， 3000 r/min离心1 min， 沉淀后去除上清液， 将1 ml磷酸缓冲液加入其中， 混匀， 获得去污染样本。

1. 3 方法

1. 3. 1 比例法药敏试验 取适量去污染样本在酸性固体罗氏培养基上接种， 在37℃温度下培养7 d， 菌群鉴定采用齐-尼氏染色法， 共得结核分枝杆菌分离株64株。制备10-2 g/L和10-4 g/L菌悬液， 各取0.01 ml采用划线法接种在含药培养基及对照培养基表面， 37℃温度下培养4周， ≤1%为敏感。

1. 3. 2 快速检测方法的建立 采用PCR线性杂交酶显色法建立快速检测方法。取去污染样本500 μl加入1.5 ml离心管， 以5600 r/min的速度离心15 min后去上清液， 加入去离子水500 μl， 再次以5600 r/min的速度离心15 min， 沸水浴20 min， 超声裂解15 min， 取上清液5 μl为DNA模板。采用BLAST软件对katG、inhA和rpoB基因合适的扩增区域进行引物扩增， 其中katG基因2个探针， inhA基因2个探针， rpoB基因11个探针。PCR扩增体系（引物1 μl， 2.5 mmol/L三磷酸脱氧核糖核苷混合物4 μl， 10×PCR缓冲液5 μl， MgCl2 3 μl， DNA聚合酶5.0 U， 去离子水3 μl， 提取的DNA模板5 μl）进行PCR扩增。扩增条件：第一阶段：95℃ 15 min， 95℃ 30 s， 58℃ 2 min， 10个循环；第二阶段：95℃ 25 s， 53℃ 40 s， 70℃ 40 s， 30个循环；第三阶段：70℃ 8 min。取20 μl PCR扩增产物加入杂交盘中， 与20 μl变性裂解液混匀， 室温静置5 min后， 加入1 ml杂交缓冲液， 放入探针试条。将杂交盘放入GTblot-20全自动杂交仪， 杂交成功后取出试纸吸水纸干燥， 判读。

1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计数资料以率（%）表示， 采用χ2 检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

比例法药敏试验中仅对利福平耐药26份， 仅对异烟肼耐药23份， 对利福平和异烟肼均耐药19份， 不耐药20份。快速检测方法中对利福平耐药24份， 仅对异烟肼耐药24份， 对利福平和异烟肼均耐药22份， 不耐药18份。以耐药不耐药作为分割点， 比例法药敏试验结果为参考标准， 快速检测方法的灵敏度100.0%（68/68）， 特异度90.0%（18/20）， 准确度97.7%（86/88）， 两种检验方法一致性好（P=0.1573>0.05）。

3 讨论

目前， 基于分子生物学研究的利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法包括实时PCR单链构象多态性分析、实时PCR熔解曲线法、噬菌体法、基因芯片法及PCR线性杂交酶显色法等， 后两种方法应用最为广泛。这些方法预测耐药表型均基于结核分枝杆菌的rpoB、katG和inhA基因特定区域或位点突变[2]。约96%的利福平耐药性与rpoB突变相关， 30%～60%的异烟肼耐药性与katG基因突变相关， 故上述基因区域可基本覆盖耐药基因突变情况， 为检测技术的灵敏度和准确性提供保障。PCR线性杂交酶显色法也可见于慢性乙型肝炎病毒拉米夫定耐药研究[3]。该技术应用于结核分枝杆菌的检测时， 通过多重聚合酶链反应结合反向杂交技术， 与固定在硝化纤维条带上的特异基因杂交[4]， 显色判读。在此过程中PCR扩增效果不受细菌存活量的影响、杂交后化学信号放大， 是PCR线性杂交酶显色法的灵敏度高的主要原因。本研究结果显示快速检测方法的灵敏度100.0%， 特异度90.0%， 准确度97.7%， 结果与李大登等[5]报道一致。本研究纳入为疑似耐药结核病患者， 故耐药阳性检出率为77.27%（68/88）， 远高于其他报道的总耐药率29.14%[6]， 符合事实。此外， 与比例法药敏试验相比， PCR线性杂交酶显色法成本更低， 更利于在地市级结核病医院实验室应用[7]。另外本研究中PCR线性杂交酶显色法整个操作过程≤6 h， 可做到当天送检当天出结果， 符合快速检测的要求。

综上所述， 采用PCR线性杂交酶显色法建立利福平和异烟肼耐药基因突变快速检测方法进行检测， 与比例法药敏试验一致性好， 可信度高， 值得临床推广。

参考文献

[1] 欧维正， 骆科文， 王燕， 等.基因芯片与比例法药敏性试验检测结核分支杆菌对利福平和异烟肼耐药性的比较研究.检验医学， 2013， 28（5）：404-407.

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[收稿日期：2015-11-09]