金华地区血小板献血者血小板基因的分型特点和基因库建设

钱江 杜晓明 吴昕

血小板的主要功能是止血，但由于血小板表面存在复杂的抗原系统，患者多次输注血小板很大程度会引发同种免疫反应，造成血小板输注无效（platelet transfusion refractoriness，PTR）。PTR 发生机制主要与两类抗原有关，即人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-A、B 和人类血小板抗原（human platelet antigen，HPA）[1]。有研究表明，反复输注血小板的患者中HLA 抗体阳性者占80%，而HPA 抗体阳性者仅占20%[2]。为PTR 患者输注HLA 和HPA 配型相合的血小板可以显著提高血小板输注效果，本研究对金华地区单采血小板献血者HLA-A、B 和HPA 抗原的等位基因进行检测分析，通过对血小板基因分型，为患者提供主要抗原基因型相匹配的血液制品，并建立相应的血小板基因库。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2020 年1 月至2021 年2 月金华市中心血站单采血小板献血者109 名，其中男63 名，女46名；年龄18～≤25 周岁30 名，＞26～≤35 周岁25 名，＞36～≤45 周岁27 名，＞46～≤55 周岁25 名，＞56～60 周岁2 名。所有献血者均符合《献血者健康检查要求》的规定。按照《血站技术操作规程2019》的要求，在采血结束后，采用带分离胶的促凝管留取约8 mL 的血液标本备用。所有献血者在健康状况征询环节已对其告知血小板建设基因库的相关内容并签署相关同意书。本研究经金华市中心血站医学伦理委员会审查通过（批准文号：2023-03-01）。

1.2 仪器与试剂 HPA 与HLA-A、B 基因分型检测试剂盒（荧光PCR 法）（江苏伟禾生物科技有限公司，批号：202101J）；血液基因组DNA 柱式小量提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，批号：03821），所有试剂均在有效期内。高速台式离心机（型号：Heraeus Pico 17，美国Thermo 公司）；DNA 浓度测定仪（分光光度计）（型号：NanoDrop one，美国Thermo 公司）；恒温震荡孵育器（型号：TMS200，杭州奥盛仪器有限公司）；混匀器（型号：VORTEX-5，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；台式低速离心机（型号：Mini-P25，杭州奥盛仪器有限公司）；荧光定量PCR 仪（型号：ABI 7500，美国ABI 公司）。所有设备运行正常，均符合使用要求。

1.3 方法

1.3.1 试剂准备 从冰箱中取出各组分试剂，室温平衡30 min，摇匀后用台式低速离心机2 000 r/min 离心3 min，将试剂盒中的反应板严格避光操作转移至96孔板架上备用。准备反应所需HLA、HPA 的主反应液、酶混合液、灭菌水、光学封膜等耗材，按照要求制备DNA 反应模板，使其吸光度值（A）在260～280 nm 时比值1.6～2.0，浓度15～40 ng/μL。

1.3.2 加样 配制混合反应液，以1 个标本的检测量为例，在反应板上每孔加入18 μL 混合母液，加样完毕后贴上光学封膜，并压紧封膜，2 000 r/min 离心3 min，使所有液体沉降至管底，配置见表1。

表1 混合反应液配置表

1.3.3 PCR 扩增 按照操作说明对扩增仪进行循环参数设定，对5（6）羧基荧光素通道（FAM）、六氯-6-甲基荧光素通道（HEX）、羧基-X-罗丹明通道（ROX）、花菁染料通道（CY5）等通道的荧光强度进行检测，判断其是否正常。分别将荧光阈值参考值调整为FAM5000、HEX5000、ROX10000、CY55000，基线参考值调整为3～15。将混合反应液放入扩增仪，95 ℃预变性150 s，94 ℃变性15 s，65 ℃退火和延伸55 s，完成PCR 扩增。

1.3.4 判定标准与结果分析

1.3.4.1 判定标准 扩增结束后，观察各孔的扩增曲线和循环阈值（cycle threshold，CT），若标记探针扩增曲线正常且CT＜32，判断该标记探针为阳性反应；若无扩增曲线或CT≥32，判断该标记探针为阴性反应；扩增曲线异常（基线上扬、无典型指数扩增期）应重新检测。

1.3.4.2 结果分析 根据HPA 与HLA-A、B 基因检测试剂盒的试剂说明书中的HPA/HLA-A、B 判读表，确定HLA-A、B 位点、HPA-1～6、10、15、21 位点的基因分型结果。

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0 统计软件。HLA 和HPA 基因频率采用χ2检验，HPA 分布频率采用Hardy-Weinberg 平衡验证，采用Arlequin 3.5.2.2 软件对HLAA、B 位点进行Hardy-Weinberg 平衡检验。金华地区和其他地区分布的差异采用χ2检验，HLA、HPA 对偶抗原配合度用错配率（mismatch possibility，MMP）表示，MMP=2ab（1-ab），a、b 为对偶抗原等位基因频率[2]。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金华地区血小板献血者HLA-A、B 位点基因频率 检出HLA-A 位点等位基因14 个，基因频率较高的等位基因分别是A*02、A*11、A*24、A*33，见表2；检出HLA-B 位点等位基因24 个，基因频率从高到低分别是B*40、B*15、B*46、B*58、B*55、B*39、B*13，见表3。

表2 金华地区109名血小板献血者HLA-A 位点等位基因频率

表3 金华地区109名血小板献血者HLA-B 位点等位基因频率

2.2 金华地区血小板献血者HLA-A、B 高频等位基因与其他地区的比较 金华地区的A*02 等位基因分布频率与云南、辽宁和广东相比，差异均有统计学意义（χ2=22.533、11.101、9.217，P＜0.001、0.001、0.002）；金华地区的A*11 等位基因分布频率与云南、河南、辽宁、淄博和广东相比，差异均有统计学意义（χ2=24.305、13.539、11.127、12.725、12.429，P＜0.001、＜0.001、0.001、＜0.001、＜0.001）；金华地区的A*24 等位基因分布频率与西安、云南、河南、辽宁、淄博、广东相比，差异均无统计学意义（χ2=0.747、0.072、1.508、1.006、0.149、3.470，P=0.387、0.788、0.219、0.316、0.699、0.062）；金华地区的B*40 等位基因分布频率与西安、云南、河南、辽宁、淄博地区相比，差异均有统计学意义（χ2=42.643、29.151、66.627、93.159、36.130，均P＜0.001）；金华地区的B*15 等位基因分布频率与西安、云南、河南、辽宁、淄博地区相比，差异均有统计学意义（χ2=13.034、6.287、25.429、19.922、17.535，P＜0.001、0.012、＜0.001、＜0.001、＜0.001）；金华地区的B*46 等位基因分布频率与西安、河南、辽宁、淄博和广东地区相比，差异均有统计学意义（χ2=4.305、6.339、5.238、5.132、17.420，P=0.038、0.012、0.022、0.023、＜0.001），见表4。

表4 金华地区血小板献血者HLA-A、B 等位基因频率与不同地区的比较

2.3 金华地区血小板献血者HLA 等位基因Hardy-Weinberg 平衡检验 HLA-A、B 2 个位点基因的遗传平衡检验P＞0.05（HLA-A：P=0.090；HLA-B：P=0.415），说明样本选取具备一定的代表性，符合Hardy-Weinberg 遗传平衡。

2.4 金华地区血小板献血者HPA-1～6、10、15、21 基因型和基因频率分布 结果发现，HPA-4a、10a 呈单特异性，未检测出相应的对偶基因抗原。HPA-1～6、10、15、21 基因型中杂合度最高的是HPA-15 和HPA-3，HPA-15a/15a、HPA-15a/15ab、HPA-15b/15b 的频率分别是0.294、0.459、0.248；HPA-3a/3a、HPA-3a/3b、HPA-3b/3b 的频率分别是0.385、0.450、0.165。经Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，发现金华地区HPA-1～3、6、15、21 的基因频率符合遗传平衡法则，基因具有恒定性，见表5、6。

表5 金华地区109名血小板献血者HPA基因型和基因频率分布

表6 金华地区109 名血小板献血者HPA 等位基因频数比较

2.5 金华地区血小板献血者HPA 基因频率与不同国家和地区的比较 金华地区HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5、HPA-6、HPA-15 基因型与淄博、潍坊、上海、重庆比较，差异均无统计学意义（HPA-1：χ2=0.004、0.005、0.158、0.184，P=0.947、0.944、0.691、0.668；HPA-2：χ2=1.606、1.297、0.020、0.697，P=0.205、0.255、0.887、0.404；HPA- 3：χ2=0.114、0.007、0.168、0.669，P=0.736、0.936、0.682、0.413；HPA- 4：χ2=0.191、0.544、0.547、0.410，P=0.662、0.461、0.460、0.522；HPA-5：χ2=0.050、0.391、0.131、2.942，P=0.824、0.532、0.718、0.086；HPA-6：χ2=0.010、0.052、0.132、0.066，P=0.920、0.819、0.717、0.798；HPA- 15：χ2=0.083，0.440、0.817、0.135，P=0.774、0.507、0.336、0.713）。金华地区HPA-1、HPA-5、HPA-15 与英国白人比较，差异均有统计学意义（χ2=15.891、5.613、29.350，P＜0.001、0.018、＜0.001）；金华地区HPA-1、HPA-2、HPA-5 与美国黑人比较，差异均有统计学意义（χ2=6.349、9.580、19.559，P=0.012、0.002、＜0.001），见表7。

表7 金华地区血小板献血者HPA 基因频率与不同国家和地区的比较

3 讨论

血小板输注在治疗出血性疾病中起到了重要作用，已成为一种重要的临床治疗手段。但是由于输血、妊娠或骨髓移植等因素，机体可能会产生针对HLA、HPA 以及CD36 等抗原的血小板特异性抗体而导致PTR 的发生，尽管临床上可以通过血小板交叉配合试验来降低免疫性输血反应，但并不能完全规避PTR 的发生，因此血小板的配合性输注成为困扰临床输血的难题。

有研究表明，HLA 抗体是导致机体发生PTR 最常见的免疫性因素，约占所有免疫因素的80%左右[14]。本次HLA 等位基因频率调查中发现，金华地区人群A*02、A*11、B*40、B*15、B*46 等位基因分布频率与西安、云南、河南、辽宁、淄博、广东地区比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），仅A*24 基因分布频率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。对HLA 等位基因进行Hardy-Weinberg 平衡检验[15]，发现HLA-A、B 等位基因均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡规律。以上调查结果说明金华地区人群HLA-A 和HLA-B 等位基因的分布具有较强的多态性和较高的均衡性。

另有研究表明，同种免疫血小板减少症患者体内HPA 出现频率与对偶抗原的不配合率密切相关，对偶抗原不配合率越高，机体产生血小板抗体的概率就越大[16]。本次HPA 等位基因频率研究调查发现，HPA-4a、10a 呈单特异性，未检测出相应的对偶基因抗原，与南宁地区报道一致[17]。HPA-3 和HPA-15 杂合度最高且呈现对偶抗原不配合现象，与韩瑜等[18]、陈涵薇等[19]、陈扬凯等[20]报道一致。HPA-1、2、4、5、6、21 系统以aa 基因型为主，HPA-1、2、4、6、10、21 未检出bb 纯合子，与南京地区报道一致[21]。金华地区人群HPA 等位基因分型结果与国内多地数据比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与英国和美国人群相比，HPA-1、HPA-2、HPA-5、HPA-15 的基因频率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。对HPA 等位基因进行Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，发现金华地区人群HPA-1～3、6、15、21 的基因频率符合遗传平衡法则，仅HPA-5不符合平衡法则，可能是由于人群基因突变导致地域差异所致。以上研究结果表明，金华地区人群HPA 等位基因与国内大多数地区人群一致，但与英国和美国具备明显差异，造成这种结果的原因是由于中国人群与外国人群的遗传背景不同导致HPA 等位基因分布的多态性。

通过HLA 和HPA 等位基因频率分布研究，可以基本掌握金华地区HLA 和HPA 基因多态性数据，对于初步建立起金华地区血小板基因库有着重要的提示和指导作用。有研究报道称，血小板匹配性输注可以有效减少PTR 的发生率[22]。因此，建立血小板基因库的目的是从已知分型血小板供者库中迅速找到匹配型供者，为患者提供配合型血小板，降低PTR 的发生率。但是由于HLA 和HPA 存在广泛的遗传多态性，使血小板配型工作变得十分复杂，这就需要建立一个库容适中的血小板基因库，用以增加血小板配型成功的概率。据文献报道，在一个库容量为5 000 人的血小板基因库中，患者会有80%的概率匹配到5个A 级配合度的血小板供者[2]。但是由于个体差异和不同的遗传背景，患者在同一血小板基因库中找到配合性供者的概率差别也很大。因此，各地在建立血小板基因库时，要严格按照当地人群HLA 和HPA 基因分布频率来建库，以此满足临床配型需要。为促进临床血小板应用的科学性和提高血小板输注效果，浙江省血液中心在2019 年联合全省各市中心血站成立全省采供血系统血小板基因库协作组，协作组通过构建全省献血者血小板抗原基因分型数据库，实施基因库资源共享。全省联合建库模式能够对金华地区血小板基因库进行有效扩容，实现血小板资源整合，为患者提供配合型血小板，降低PTR 的发生率，提高血小板输注效率。