UCA1/miR-122-5p/CPEB1轴促进肺腺癌的顺铂耐药发生机制研究

吴玲玲 陈姝慧 胡天奇 周辰康 仇鲁男 王瑜敏

在全球，肺癌的发病率和死亡率居各种癌症之首[1]。2016 年中国恶性肿瘤流行数据显示，恶性肿瘤死亡第1 位是肺癌，发病率和死亡率分别位列男性肿瘤首位，女性肿瘤第2 位和第1 位[2]。非小细胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC）在肺癌中最为多见，肺腺癌是NSCLC 中最常见的类型，占肺癌的40%，占NSCLC 的50%。目前肺腺癌的发病率在全球范围呈不断上升趋势，由于肺腺癌具有早期出现远处转移的生物学特点，多数患者确诊时已属晚期。以顺铂为基础的联合化疗在肺腺癌的综合治疗方案中占有重要地位[3]。但随着顺铂的应用，不可避免会引起肿瘤细胞对其产生耐药性，使化疗效果明显降低[4]。据美国癌症协会调查显示，90%以上肿瘤患者的死亡在不同程度上与肿瘤耐药性产生有关，癌细胞一旦对顺铂产生耐药，会对阿霉素、长春碱、氟尿嘧啶、丝裂霉素等众多一线化疗药物形成多药耐药，其危害尤为严重[5]。本研究团队前期已采用高通量长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）芯片技术比较肺腺癌顺铂耐药株A549/DDP 细胞与顺铂敏感株A549 细胞，获得了肺腺癌顺铂耐药株差异性lncRNA 表达谱，筛选并初步鉴定出一些与肺腺癌顺铂耐药相关的lncRNA 分子，其中通过lncRNA 芯片及实时荧光反转录定量PCR（real-time fluorescence reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR）检测结果均证实了尿路上皮癌胚抗原1（urothelial carcinoembryonic antigen 1，UCA1）为这些候选基因中明显上调的lncRNA 分子。UCA1 首先被证实在膀胱癌组织呈高表达[6]，在其他癌症也显示为高表达。UCA1 经常与miRNA 进行互作[7]，而是否通过与相关miRNA 分子进行竞争性内源RNA（competing endogenouse RNA，ceRNA）调控肺腺癌对顺铂耐药的机制？本研究拟在前期工作的基础上，根据miRNA 预测网站预测的交集，获得UCA1 调控相关miRNA 分子，重点针对UCA1 相关miR-122-5p 分子进行研究，旨在探讨UCA1 通过miR-122-5p 参与调控肺腺癌顺铂耐药的机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 RPMI 1640 培养基（批号：C11875500BT）、DMEM 培养基（批号：12800017）、opti-MEM 培养基（批号：31985-070）购自美国Gibco公司（规格：500 mL/瓶）。顺铂注射液购自江苏豪森药业集团有限公司（批号：SL2138596，规格：6 mL∶30mg×5 支）。FBS 购自美国Gibco 公司（批号：16000-044）。miR-122-5p 模拟物、miR-122-5p 模拟物阴性对照（NC）、miR-122-5p 抑制剂、miR-122-5p 抑制剂NC、质粒pcDNA-胞质多聚腺苷酸元件结合蛋白1（cytosolic polyadenyl element binding protein 1，CPEB1）、对照载体pcDNA-3.1 均购自广州锐博生物科技有限公司（规格：50 μg/支）。Lipofectamine 3000 购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司（批号：16000-044）。miDETECT A TrackTMmiRNA qPCR试剂盒购自锐博生物科技有限公司（批号：C10710）。双荧光素酶报告分析系统试剂盒购自美国Promega 公司（批号：ZY130595）。RrimeScriptTMRT Master Mix、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自日本Takara 公司（批号：RR036A、RR420A）。Trizol 试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific 公司（批号：ALH005，规格：200 mL/瓶）；氯仿、异丙醇购自天津大茂化学试剂厂（批号：S19382、N32930，规格：10 mg/瓶）。CCK-8 试剂盒购自日本同仁公司（批号：C0038，规格：2 mL/瓶）。pmiRGLO-UCA1-野生型（WT）/突变型（Mut）载体、pmiRGLO- CPEB1-3'UTR-WT/Mut 载体均购自锐博生物科技有限公司。 311 型CO2培养箱购自美国赛默飞公司；ABI 7500 PCR 仪器购自美国ABI 公司；Nanodrop 2000 仪器购自美国Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 细胞培养 肺腺癌细胞（HCC827、A549、H1299）和正常人支气管上皮细胞（BEAS-2B）系购自中国科学院细胞库。其中A549（顺铂敏感细胞株）、H1299 和HCC827 细胞保存在含有10%FBS 的RPMI 1640 培养基中，BEAS-2B 细胞保存在含有10%FBS 的DMEM 培养基中，并在37 ℃、5%CO2条件下培养。所有培养物均经过常规检测，未发现支原体或真菌污染。A549/DDP细胞（顺铂耐药细胞株）购自中国科学院细胞库，在培养基加入1 μg/mL 顺铂，以保持其抗药性。A549 过表达UCA1 及A549 过表达NC 细胞系前期已经构建完毕，可用于直接培养。所有细胞系均按照建议在含10%FBS 的RPMI 1640 培养基中培养，并置于37 ℃、5%CO2的311型CO2培养箱中。

1.3 转染 准备miR-122-5p 模拟物、miR-122-5p 模拟物NC、miR-122-5p 抑制剂、miR-122-5p 抑制剂NC、pcDNA-CPEB1、对照载体pcDNA-3.1 等质粒。转染前1 天，以50%的细胞密度分别将A549、A549/DDP细胞株接种到12 孔板中，待细胞数量增加达到实验要求后待用。转染前2 h，将含有10%FBS 的RPMI 1640 完全培养基换为opti-MEM 培养基；制备聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）和上述质粒的转染复合物，上述质粒的瞬时转染浓度为50 nmol/L；分别用50 μL opti-MEM 培养基稀释2 μL PEI 和1.25 μL 上述质粒，随后将稀释好的PEI 和上述质粒混匀，置于室温孵育15 min。将100 μL 上述质粒转染复合物加入细胞株培养基中，十字混匀摇匀，转染8 h 后更换为500 μL 含有10%FBS 的RPMI 1640 完全培养基。获得构建A549 miR-122-5p 模拟物NC 细胞株、A549 miR-122-5p 模拟物细胞株、A549/DDP miR-122-5p 抑制物NC 细胞株、A549/DDP miR-122-5p 抑制物细胞株、A549 CPEB1 过表达NC 细胞株、A549 CPEB1 过表达细胞株；通过RTqPCR 验证转染效率。

1.4 总RNA提取和qPCR检测UCA1相关miRNA分子

1.4.1 细胞总RNA 提取 收集A549 和A549/DDP 的各处理组细胞沉淀于1.5 mL 的EP 管中，加入1 mL的Trizol，混匀后置于冰上充分裂解细胞10 min。向每个EP 管加入200 μL 氯仿于冰上静置10 min 后离心15 min。吸取上层水相溶液400 μL 至新的EP 管，按同等体积比加入预冷的异丙醇，颠倒混匀后冰上静置15 min 后离心15 min。吸去上清液，留RNA 沉淀，加入1 mL 75% 乙醇轻柔吹洗，离心5 min。吸干乙醇，开盖5 min 使乙醇充分挥发，加入15 μL RNase-free 水使其溶解。

1.4.2 RNA 浓度检测 使用Nano drop 2000 仪器，开机选择RNA 浓度测定程序，用2 μL DEPC 水调零后进行检测；取1 μL RNA 样品进行测定，A260/A280值位于1.8～2.0表示RNA 提取合格，保存于-20 ℃用于后续实验。

1.4.3 RNA 反转录为cDNA 按RrimeScriptTMRT Master Mix 试剂盒说明书，配制反转录体系。PCR 仪设定以下程序：反转录37 ℃，15 min；RNA 酶失活85 ℃，5 s；反应终止4 ℃，30 min；将样本置于PCR 仪中进行反转录反应得到cDNA，保存于-20 ℃待用。用于检测miRNA 的RNA 样本反转录采用miDETECT A TrackTMmiRNA qPCR Kit，操作步骤按miDETECT A TrackTMmiRNA qPCR 试剂盒说明书，配制Poly(A) Tailing 体系，混匀后于37 ℃反应1 h，4 ℃保存备用。

1.4.4 RT-qPCR 稀释引物前先进行瞬时离心使其沉于管底，按照管身的说明加入相应体积×10 的去离子水，得到10 μmol/L 的工作引物浓度，并置于-20 ℃冰箱保存；按TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书制备10 μL 荧光定量PCR 体系；采用PCR 仪为ABI Q5 PCR 仪，设定PCR 反应程序：95 ℃预变性30 s；40 个循环包括：95 ℃变性5 s，55 ℃退火和延伸34 s。以β-肌动蛋白（β-actin）和U6 作为内部参考，结果分析采用2-ΔΔCt法，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 双荧光素酶报告实验 构建含有miR-122-5p 结合位点的WT 和Mut 序列UCA1 和CPEB1 的质粒，并克隆到含有pmiRGLO 启动子的双荧光素酶报告质粒中，得到pmiRGLO-UCA1-WT/Mut 和pmiRGLO-CPEB1-3'UTR-WT/Mut双荧光素酶报告载体。具体实验分组为：miR-122-5p模拟物NC，miR-122-5p 模拟物，UCA1 WT+miR-122-5p 模拟物NC，UCA1 WT+miR-122-5p模拟物，UCA1 Mut+miR-122-5p模拟物NC，UCA1 Mut+miR-122-5p 模拟物；CPEB1 WT+miR-122-5p 模拟物NC，CPEB1 WT+miR-122-5p 模拟物，CPEB1 Mut+miR-122-5p 模拟物NC，CPEB1 Mut +miR-122-5p 模拟物。将A549 细胞接种到24 孔板中，置于37 ℃、5%CO2的311 型CO2培养箱中培养24 h，将miR-122-5p 模拟物或模拟物NC 与构建的报告载体pmiRGLOUCA1-WT/Mut 或pmiRGLO- CPEB1-3'UTR-WT/Mut 共转染48 h，最后用双荧光素酶报告分析系统试剂盒评价相对荧光素酶活性。

1.6 顺铂敏感性试验 将A549 和A549/DDP 细胞接种在96 孔板中（2×103个/孔），并培养至细胞贴满。随后，用不同浓度顺铂（0、1、2、4、8、10 μg/mL）培养基代替RPMI 1640 培养基培养细胞48 h，用10%CCK-8替换每个孔中的培养液并培养1 h。用微孔板阅读器在450 nm 处测量吸光度（A），并计算细胞活力，细胞活力（%）=（A加-A空白）/（A0加药-A空白）×100%，其中A 加是指不同顺铂浓度（1、2、4、8、10 μg/mL）后细胞株的吸光度值，A 空白是指没加细胞株，没加药物的培养基吸光度值，A0 加药是指加入顺铂马上检测的吸光值。使用GraphPad Prism 8.0 软件计算顺铂的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.7 公共数据库进行生物信息学分析 从肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）公共数据库中下载肺腺癌及正常肺样本的基因组数据，其中肺腺癌535例，匹配的正常肺样本59个；肺腺癌组与正常组之间CPEB1 基因表达水平差异比较采用两独立样本t检验。绘制ROC曲线评价CPEB1基因诊断肺腺癌的效能，并计算AUC。采用Kaplan-Meier法绘制低表达组和高表达组患者的生存曲线，总生存期比较采用log-rank 检验。选择与CPEB1 基因表达相关的免疫细胞，以CPEB1基因表达高低来分组，比较免疫细胞浸润的差异。

1.8 统计学处理 采用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 22.0 统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验，配对样本比较采用配对样本t检验；计数资料组间比较采用χ2检验和Fisher 确切概率法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCA1 与多个miRNA 发生互作关系 根据miRNA预测网站http://www.microrna.org/microrna/home.do 和http://www.mircode.org/预测的交集，获得UCA1调控相关miRNA（包括miR-143、miR-18a、miR-18b、miR-96-3p、miR-1271、miR-135a、miR-135b、miR-122-5p、miR-193a、miR-193b、miR-203a）。进一步通过RT-qPCR 检测获得miR-122-5p、miR-203a、miR-143、miR-135a、miR-135b 作为UCA1 互作miRNA 分子参与肺腺癌的顺铂耐药发生，见图1。

图1 UCA1 互作miRNA 分子表达水平比较结果（A：A549/DDP 和A549 细胞株的差异miRNA 表达情况；B：UCA1 过表达后差异miRNA 的表达情况）

2.2 检测肺腺癌细胞及BEAS-2B 细胞中miR-122-5p的表达水平 双荧光素酶报告实验结果表明，miR-122-5p 在肺腺癌细胞中的表达水平明显升高，见图2A。与miR-122-5p 模拟物NC、miR-122-5p 模拟物、UCA1 WT+miR-122-5p 模拟物NC、UCA1 Mut+miR-122-5p 模拟物NC、UCA1 Mut miR-122-5p 模拟物相比较，UCA1 WT+miR-122-5p 模拟物共转染组的相对荧光素酶活性明显下降，见图2B，表明miR-122-5p 和UCA1 具有结合位点。

图2 肺癌细胞及BEAS-2B 细胞中miR-122-5p 表达水平的比较（A：miR-122-5p 在肺腺癌细胞株的表达情况；B：miR-122-5p 模拟物或模拟物NC 与构建的报告载体pmiRGLO-UCA1-WT/Mut 共转染后荧光素酶活性比较）

2.3 miR-122-5p 对肺癌细胞株顺铂敏感性的影响RT-qPCR 结果显示成功构建了miR-122-5p 抑制物转染的细胞株，见图3A；miR-122-5p 抑制后，顺铂IC50浓度从5.1 μg/mL 下降到2.3 μg/mL，提示miR-122-5p敲低后能提高顺铂的药物敏感性，见图3B。成功构建了miR-122-5p 模拟物转染的细胞株，见图3C；miR-122-5p 过表达后，顺铂IC50浓度从2.3 μg/mL 升高到4.8 μg/mL，提示miR-122-5p 过表达能减低顺铂的药物敏感性，促进顺铂耐药，见图3D。

图3 miR-122-5p 对肺癌细胞株顺铂敏感性的影响（A：miR-122-5p 抑制物转染A549/DDP 细胞株后miR-122-5p 表达水平的比较；B：miR-122-5p 抑制物转染A549/DDP 细胞株后顺铂IC50的变化；C：miR-122-5p 模拟物转染A549 细胞株后miR-122-5p 表达水平的比较；D：miR-122-5p 模拟物转染A549 细胞株后顺铂IC50的变化）

2.4 miRNA 荧光素酶发现miR-122-5p 与CPEB1 存在结合 进一步通过https://www.targetscan.org/vert_71/和https://www.mirbase.org/网站预测，发现miR-122-5p 与CPEB1 可能存在结合。随后检测肺腺癌细胞及BEAS-2B 细胞中CPEB1 的表达水平，发现CPEB1 在肺腺癌细胞中的表达水平明显降低，见图4A。双荧光素酶报告实验结果表明，与miR-122-5p 模拟物NC、miR-122-5p 模拟物、CPEB1 WT+miR-122-5p 模拟物NC、CPEB1 Mut+miR-122-5p 模拟物NC、CPEB1 Mut miR-122-5p 模拟物组比较，CPEB1 WT +miR-122-5p 模拟物组的相对荧光素酶活性明显下降，见图4B，表明miR-122-5p 和CPEB1 具有结合位点。

图4 miR-122-5p 与CPEB1 的双荧光素酶活性实验（A：CPEB1 在肺腺癌细胞株的表达情况；B：miR-122-5p 模拟物或NC 与构建的报告载体CPEB1 WT 及CPEB1 Mut 共转染后相对荧光素酶活性的比较）

2.5 CPEB1 对肺腺癌细胞株顺铂敏感性的影响 RTqPCR 结果显示成功构建了CPEB1 过表达细胞株，见图5A；CPEB1 过表达后，顺铂IC50浓度从5.2 μg/mL 下降到2.5 μg/mL，见图5B，提示CPEB1 过表达能提高顺铂的药物敏感性，降低顺铂耐药。

图5 CPEB1 对肺腺癌细胞株顺铂敏感性的影响（A：CPEB1 过表达质粒转染A549/DDP 细胞株后CPEB1 表达水平的比较；B：CPEB1 过表达后A549/DDP 细胞株后顺铂IC50的变化）

2.6 CPEB1 在肺腺癌表达及与免疫细胞功能的相关性 TCGA 公共数据库分析显示肺腺癌组织CPEB1 mRNA 明显低于癌旁组织，见图6A、B；ROC 曲线分析显示CPEB1 表达水平能较好地用于诊断肺腺癌（AUC=0.849，95%CI：0.810～0.888），见图6C，高CPEB1水平与低CPEB1 水平患者的生存预后差异无统计学意义，见图6D；CPEB1 表达水平与肺腺癌患者的细胞功能如T 细胞、B 细胞、CD8+T 细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞存在密切关联，见图6E。

图6 数据库CPEB1 mRNA 表达情况（A：CPEB1 在肺腺癌组织的表达情况；B：CPEB1 在肺腺癌组织的表达情况；C：ROC 曲线分析CPEB1 用于肺腺癌的诊断效能；D：高CPEB1 水平与低CPEB1 水平患者生存预后的比较；E：CPEB1 表达水平与肺腺癌患者的细胞功能相关性）

3 讨论

近年来国内外研究表明，顺铂主要通过抑制肿瘤细胞DNA 合成[8]、诱导凋亡[9]而发挥作用。顺铂化疗抵抗制极其复杂，是一个多基因参与的复杂事件，目前认为主要通过如下几种机制[10]来实现：（1）改变细胞内药物转运；（2）降低药物活性干扰药物作用机制；（3）影响DNA 损伤修复，目前相关基因如乳腺癌相关基因1、切除修复交叉互补基因等；（4）主要信号通路（PDK/Akt、MAPK/Erk、Wnt 等）的遗传和表观遗传学改变，使药物作用凋亡受阻。然而，令人遗憾的是，尽管以往包括基因组学和蛋白质组学研究取得了不少进展，但顺铂化疗抵抗机制仍尚未阐明。

有研究发现，UCA1 可通过与miRNA 进行互作，参与顺铂耐药机制[11]。目前文献报道UCA1 通过CREB调节膀胱癌细胞中的miR-196a-5p 促进顺铂/吉西他滨耐药[12]。UCA1 表达失调可能通过调节microRNA-495/NRF2 信号通路参与顺铂治疗NSCLC 化疗耐药的发生[13]。本研究通过筛选到UCA1 的多个相关miRNA，表明UCA1 可与miRNA 互作参与肺腺癌的顺铂耐药机制；结合相关文献[14]，笔者初步选定miR-122-5p作为后续的研究对象，发现miR-122-5p 在肺腺癌细胞中的表达水平明显升高，并通过双荧光素酶报告实验以验证UCA1 与miR-122-5p 结合，构建miR-122-5p 抑制物和模拟物转染肺腺癌细胞株，发现miR-122-5p 抑制后，顺铂IC50浓度下降，而miR-122-5p 过表达后，顺铂IC50浓度升高，提示miR-122-5p 能降低顺铂的药物敏感性，促进肺腺癌顺铂耐药。

本研究通过https://www.targetscan.org/vert_71/和https://www.mirbase.org/网站预测，发现miR-122-5p 与靶基因CPEB1 可能存在结合。CPEB1 是指一种序列特异性的RNA 结合蛋白，可以调节mRNA 多聚腺苷酸化和翻译以及肿瘤的发生[15]。进一步发现CPEB1 在肺腺癌细胞中的表达水平明显降低，双荧光素酶报告实验证实CPEB1 是与miR-122-5p 结合；构建CPEB1 过表达质粒染肺腺癌细胞株，CPEB1 过表达后，顺铂IC50浓度减低，提示CPEB1 过表达能提高顺铂的药物敏感性，减低顺铂耐药，表明CPEB1 参与肺腺癌顺铂耐药机制。有报道显示，CPEB1 降低会导致体内乳腺癌细胞肺转移[16]。本研究对公共数据库分析显示肺腺癌组织CPEB1 mRNA 明显低于癌旁组织，ROC 曲线分析显示CPEB1 表达水平能较好地用于诊断肺腺癌（AUC=0.849），分析显示CPEB1 表达水平与肺腺癌患者的细胞功能如T 细胞、B 细胞、CD8+T 细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞存在密切关联。

综上所述，UCA1 与miR-122-5p 存在结合位点，后者可影响肺腺癌的顺铂耐药，并与靶基因CPEB1 结合；肺腺癌中CPEB1 呈低表达，降低肺腺癌顺铂药物的敏感性。UCA1/miR-122-5p/CPEB1 轴有望为干预肺腺癌顺铂耐药的靶点。