丙氨酸抑制PKM2表达对缺血性脑损伤保护作用

王茜钰然 高靖辰 葛承延 王倚天 万芪

［收稿日期］2022-11-20;  ［修訂日期］2023-03-17

［基金项目］国家自然科学基金资助项目（82071385）

［第一作者］王茜钰然（1995-），女，硕士研究生。

［通信作者］万芪（1962-），男，博士，教授，博士生导师。E-mail：qiwan1@hotmail.com。

［摘要］  目的

研究丙氨酸（Ala）在缺血性脑损伤中的神经保护作用以及Ala对M2型丙酮酸激酶（PKM2）表达水平的调节。

方法  体外培养原代神经元并构建氧-糖剥夺/再灌注（OGD/R）模型，将神经元随机分为对照组、OGD/R模型组以及OGD/R后Ala干预组（OGD/R+Ala），应用CCK-8方法检测Ala干预对神经元存活率的影响，Western blot方法检测Ala对OGD/R模型神经元内PKM2蛋白表达水平的影响。构建大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，随机将36只SD大鼠分为假手术组、MCAO组以及MCAO后Ala干预组（MCAO+Ala），每组12只，采用免疫荧光方法检测脑缺血/再灌注损伤后神经元内Ala含量的变化，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色观察各组脑梗死面积，Western blot方法检测Ala干预对缺血损伤脑组织中PKM2蛋白表达水平的影响。

结果

CCK-8与Western blot检测结果显示，各组神经元存活率及PKM2蛋白表达差异有显著性（F=86.88、20.83，P<0.05），OGD/R组细胞存活率较对照组显著降低，PKM2蛋白表达较对照组升高（tLSD=4.65、10.95，P<0.05）；OGD/R+Ala组细胞存活率较OGD/R组显著增加，PKM2蛋白表达较OGD/R组明显下降（tLSD=4.98、4.69，P<0.05）。免疫荧光染色结果显示，MCAO组大鼠受损神经元内Ala含量较假手术组明显降低。TTC结果显示，Ala干预使MCAO模型大鼠缺血面积减少（F=83.90，tLSD=3.41，P<0.05）。Western blot结果显示，MCAO模型组大鼠脑组织中PKM2表达水平增高，与假手术组相比差异有显著性（F=3.60，tLSD=5.10，P<0.05），Ala干预后脑组织中PKM2表达水平明显下降（tLSD=6.20，P<0.05）。

结论  Ala可能通过抑制PKM2蛋白表达减轻脑缺血/再灌注损伤从而发挥神经保护作用。

［关键词］  缺氧缺血，脑；丙氨酸；丙酮酸激酶；神经保护药

［中图分类号］  R338.2；R743

［文献标志码］  A

［文章编号］  2096-5532（2024）01-0001-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.036

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］  https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240329.0927.001;2024-04-01  12：06：17

Alanine exerts neuroprotective effects in cerebral ischemia/reperfusion injury through inhibition of PKM2

＼ WANG Xiyuran， GAO Jingchen， Ge Chengyan， Wang Yitian， WAN Qi

＼ （Institute of Neurodegeneration And Neurorehabilitation， Qingdao University，  Qingdao 266071， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the neuroprotective role of alanine （Ala） in ischemic brain injury and the regulation of M2-type pyruvate kinase （PKM2） expression levels by Ala.

＼ Methods＼ Primary neurons were cultured in vitro and an oxygen-glucose deprivation/reperfusion （OGD/R） model was constructed. Neurons were randomly divided into the sham-operated group （Sham）， oxygen-glucose deprivation/reperfusion-treated group （OGD/R）， and post-OGD/R Ala intervention group （OGD/R+Ala）. CCK-8 method was used to detect the effect of Ala intervention on neuronal survival rate. Western blot was used to detect the effect of Ala on PKM2 protein expression level in neurons of the OGD/R model. A middle cerebral artery embolization （MCAO） model was constructed in rats， and 36 SD rats were randomly divided into the sham-operated group （Sham）， middle cerebral artery embolization group （MCAO）， and post-MCAO Ala intervention group （MCAO+Ala）， with 12 rats in each group. Immunofluorescence assay was used to detect the changes of Ala content in OGD/R injured neurons. The changes in the cerebral infarct area were observed after 2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride （TTC） staining. Western blot was used to detect the effect of Ala intervention on the expression level of PKM2 protein in ischemically injured brain tissues.

＼ Results＼ CCK-8 and Western blot showed significant differences in neuronal survival rate and PKM2 expression （F=86.88，20.83;P<0.05）. Cell survival was significantly lower and PKM2 expression was higher in the OGD/R group compared with the Sham group （tLSD=4.65，10.95;P<0.05）. Compared with OGD/R， OGD/R+Ala significantly increased neuronal survival and reduced PKM2 expression （tLSD=4.98，4.69;P<0.05）. Immunofluorescence staining showed that Ala content in damaged neurons was significantly lower in the MCAO group compared with the Sham group. TTC showed that Ala intervention reduced the ischemic area in MCAO model rats （F=83.90，tLSD=3.41，P<0.05）. Western blot showed that PKM2 expression levels were significantly increased in the brain tissue of the MCAO model rats compared with the sham-operated group （F=3.60，tLSD=5.10，P<0.05）. PKM2 expression levels in brain tissue decreased significantly after Ala intervention （tLSD=6.20，P<0.05）.

＼ Conclusion＼ Ala can reduce cerebral ischemia/reperfusion injury and thus exert neuroprotective effects by inhibiting PKM2 protein expression.

［Key words］＼ hypoxia-ischemia， brain; alanine; pyruvate kinase; neuroprotective agents

缺血性脑卒中是一种高死亡率及高致残率的疾病［1-2］，主要由动脉栓塞、微血管病变或大血管病变引起，缺血性脑卒中引起的脑损伤导致脑内低氧和葡萄糖缺乏，最终引起神经功能障碍［3-5］。丙氨酸（Ala）是一种非必需氨基酸，对许多生物分子的合成至关重要。研究发现，Ala 具有神经保护作用［6］，Ala 在脑卒中病人血清中含量降低［7］，推测其在神经元内含量也可能降低并且与神经元的死亡密切相关。丙酮酸激酶（PK）为糖酵解的关键酶之一，有4种不同的亚型［8］，M2型PK（PKM2）是其中一种。研究表明，PKM2分布于脑组织中，PKM2敲除或抑制可保护缺血组织，因此推测其可能作为脑卒中后 Ala 发挥神经保护作用的下游信号［9-14］。目前， Ala 在缺血性脑损伤中对 PKM2的作用及其机制尚不明确。本研究旨在探讨 Ala 对缺血性脑损伤后神经元的保护作用及其对 PKM2表达水平的调节作用，从而为缺血性脑卒中的治疗提供新的思路。现将结果报告如下。

1  材料与方法

1.1  實验材料

1.1.1  实验动物  SPF级，出生24 h内SD胎鼠以及体质量250 g健康成年雄性SD大鼠36只，均购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，饲养于青岛大学医学部实验动物中心。

1.1.2  主要试剂  抗PKM2兔单克隆抗体、抗β-actin鼠单克隆抗体、抗MAP2小鼠单克隆抗体均购自Cell Signaling Technology公司，抗Ala兔单克隆抗体（Abcam），L-丙氨酸（Solarbio），增强型CCK-8试剂盒（Bioss），原代神经元培养相关试剂（Gibico），胎牛血清（四季青），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染料（Solarbio），Western blot相关试剂（Solarbio）。

1.2  实验方法

1.2.1  原代神经元培养  取出生24 h的SD胎鼠，用体积分数0.75乙醇消毒后，将胎鼠头剪下置于冰水混合的Hanks平衡液中，在立体显微镜下剥离胎鼠颅骨和脑膜，分离大脑皮质并将其暂存于无血清DMEM培养液中，1 000 r/min离心5 min后弃上清，加入5 g/L胰酶于37 ℃下消化25 min，加入含血清的DMEM完全培养液终止消化，1 000 r/min离心5 min后弃上清，加入无血清Neurobasal Medium培养液（含体积分数0.02 B-27 Supplement、0.01 gluta Max 100×、10 g/L青霉素-链霉素100×），将细胞重悬后细胞筛过滤，以3×108个/L密度接种于多聚赖氨酸包被的孔板中，次日全换液，此后每3 d半换液。

1.2.2  氧-糖剥夺/再灌注（OGD/R）细胞模型制备及分组  原代神经元培养10 d后，将其随机分为对照组（Sham组）、OGD/R处理组（OGD/R组）以及OGD/R后Ala干预组（OGD/R+Ala组）。用PBS轻轻冲洗3次后，OGD/R与OGD/R+Ala组加入无糖细胞外液置于37 ℃厌氧箱（内含体积分数0.01 O2+体积分数0.94 N2+体积分数0.05 CO2）中，Sham组则加入有糖细胞外液置于正常培养箱中。1.5 h后取出神经元，Sham组和OGD/R组更换为无血清神经元培养液，OGD/R+Ala组则更换为含10 μmol/L Ala的等体积无血清神经元培养液。

1.2.3  CCK-8比色法检测细胞存活率  神经元复氧24 h后每孔加入等量含体积分数0.10 CCK-8溶液的无血清培养液，置于37 ℃培养箱中孵育3 h。用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度，计算细胞存活率。细胞存活率（％）=（实验孔吸光度－空白孔吸光度）／（对照孔吸光度－空白孔吸光度）×100%。

1.2.4  免疫荧光染色  用无菌PBS漂洗细胞爬片3次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，再次用无菌PBS漂洗3次，每孔加入体积分数0.03血清封闭液（含体积分数0.025 Triton X-100）200 μL室温封闭破膜1.5 h，加入一抗（1∶300）4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次后加入二抗（1∶1 000）室温孵育2 h，再次用PBS漂洗3次，使用抗荧光猝灭封片剂封片后共聚焦显微镜下观察。

1.2.5  大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型制备及分组  采用线栓法建立大鼠MCAO模型。大鼠在异氟烷气体麻醉下仰卧位固定在手术台上，备皮后常规消毒颈部皮肤，取颈部正中切口，暴露分离动脉

血管。结扎颈总动脉近心端和颈外动脉，将线栓经颈外动脉切口处插入颈内动脉至堵塞大脑中动脉开口处，扎紧动脉残端，90 min后拔除线栓并缝合皮肤。24 h后观察大鼠肢体活动，Longa评分1～3分者选为实验对象。采用随机数字表法将SD大鼠分为假手术组（Sham组）、MCAO组以及MCAO后Ala干预组（MCAO+Ala组），每组6只。其中Sham组大鼠仅于颈外动脉处开口不进行梗阻，MCAO+Ala组在拔栓时给予10 mg/kg的Ala静脉注射，其余两组注射等量生理盐水。

1.2.6  TTC染色检测梗死面积  MCAO 24 h后，大鼠经异氟烷气体麻醉，用生理盐水进行心脏灌注，分离脑组织切成2 mm厚切片。将脑片置于200 g/L TTC溶液中37 ℃避光孵育30 min，每隔10 min晃动1次。染色后正常脑组织呈红色，梗死脑组织呈白色。用组织固定液浸泡24 h后按解剖结构从前向后摆放脑片，用扫描仪采集图像，Image J软件定量检测各组梗死面积。

1.2.7  Western blot检测PKM2表达水平  收集各组半暗带区脑组织，制备神经元样本，经裂解、研磨、离心后取上清，BCA 法检测蛋白浓度，行SDS-PAGE 凝胶电泳，每孔蛋白上样量10 μg。经电泳（80 V）、转膜（220 mA，90 min）后，50 g/L脱脂奶粉室温封闭1.5 h，加入抗PKM2兔单克隆抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜；加入二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，用 ECL 发光剂显影，洗脱条带后加入抗β-actin鼠单克隆抗体（1∶8 000），用上述方法孵育二抗及显影。采用 Image J 软件对条带进行半定量分析。

1.3  统计学分析

应用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，两组数据比较采用t检验；多组数据比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结  果

2.1  Ala 处理对OGD/R后受损神经元作用

CCK-8结果显示，各组神经元存活率比较差异有显著性（F=86.88，P<0.05）。两两比较显示，与Sham组相比，OGD/R组神经元存活率降低（tLSD=10.95，P<0.05）；与OGD/R组相比，OGD/R+Ala组神经元存活率显著增加（tLSD=4.98，P<0.05）。见表1。

2.2  Ala对OGD/R 损伤神经元内PKM2蛋白表达影响

Western blot 检测显示，各组神经元 PKM2蛋白表达水平差异具有统计学意义（F=20.83，P<0.05）。两两比较显示，OGD/R组PKM2蛋白表达较Sham组升高，OGD/R+Ala组PKM2蛋白表达较OGD/R组明显下降，差异有显著性（tLSD=4.65、4.69，P<0.05）。见图1、表1。

2.3  缺血性脑损伤后受损神经元内Ala含量变化

免疫荧光染色结果显示，MCAO组大鼠受损神经元内 Ala 含量较对照组明显降低（图2）。

2.4  Ala对MCAO大鼠脑梗死面积影响

TTC染色结果显示，各组大鼠脑梗死面积比较差异有统计学意义（F=83.90，P<0.05）。两两比较显示，MCAO组大鼠脑梗死面积较Sham组增加（tLSD=10.90，P<0.01），MCAO+Ala组大鼠脑梗死面积较MCAO组则明显减小（tLSD=3.41，P<0.05）。见图3。

2.5  Ala對缺血损伤脑组织中PKM2蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，各组脑组织缺血半暗带组织PKM2蛋白表达比较差异有统计学意义（F=3.60，P<0.05），两两比较显示，MCAO组PKM2蛋白表达水平较Sham组升高，MCAO+Ala组PKM2蛋白表达水平较MCAO组明显下降，各组比较差异均有统计学意义（tLSD=5.10、6.20，P<0.05）。见图4、表2。

神经元标记物Neun染色呈红色，Ala呈绿色，DAPI呈蓝色。

3  讨  论

脑卒中是残疾的主要原因，也是全球第二大死亡原因。其发病机制极其复杂，是细胞凋亡、兴奋性毒性、氧化应激和炎症等病理生理过程相互作用的

结果［5，15］。Ala是一种非必需氨基酸，在神经系统

中主要通过糖酵解途径及其他代谢途径产生。代谢

组学研究显示，Ala在卒中病人血清中含量降低［6］。由于氨基酸具有多种生物学功能，因此，它们的变化可能反映了缺血性脑损伤的一些关键病理生理通路。近年来的研究表明，Ala可以通过增加神经系统中脑源性神经营养因子、神经肽Y的表达并减少炎症反应从而发挥神经保护作用［16-17］。但Ala在缺血性脑损伤中的作用及机制尚不清楚。本研究从在体实验及离体实验两方面证实了Ala对缺血损伤脑组织的保护作用及其靶点。免疫荧光结果显示，缺血性脑损伤发生后，受损神经元中Ala含量顯著降低。本文应用CCK-8方法检测补充Ala是否具有神经保护作用，结果显示，在原代培养的神经元内补充Ala可以减少OGD/R导致的神经元死亡。在体实验同样支持上述结论，TTC染色结果表明，补充Ala可以减少MCAO大鼠的脑梗死面积。

PKM2是一种在糖酵解中将磷酸烯醇式丙酮酸去磷酸化为丙酮酸的酶。最近的一项研究表明，PKM2敲除小鼠在胚胎和出生后阶段没有表现出任何明显的发育异常［10］，PKM2基因敲除小鼠失

去PKM2可以通过维持线粒体生物生成来保护缺

血组织［11］。有研究表明，Ala是PKM2四聚体的变

构激活剂［12-13］；然而另有研究指出，PKM2的PK酶活性可被Ala抑制［14］。目前尚不清楚在脑缺血/再灌注损伤模型中Ala是否以及如何对PKM2进行调控。为了进一步探究Ala发挥神经保护作用的分子机制，本文采用Western blot方法检测了各组大鼠神经元以及脑组织中PKM2的表达水平，结果显示，缺血性脑损伤发生后，神经元内PKM2的表达水平显著升高，导致脑缺血面积增大、原代神经元存活率下降等一系列损伤；Ala干预使缺血面积减少，PKM2表达水平明显下降，细胞存活率显著增加。提示Ala处理可以通过抑制PKM2的表达水平发挥神经保护作用，但其下游的具体作用机制还需进一步研究。

综上所述，Ala可通过抑制PKM2蛋白表达减少MCAO模型大鼠的脑梗死面积以及OGD/R损伤神经元的死亡，发挥神经保护作用。

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（本文編辑  黄建乡）