温度胁迫下浓香型白酒酒醅理化性质、有机酸和挥发性风味物质的变化研究

2024-05-03蒋永春雷学俊覃凤阳张建敏彭志云

酿酒科技 2024年3期

蒋永春，雷学俊，郑佳，，3，覃凤阳，张建敏，彭志云，赵东，，3*

(1.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644005；2.宜宾五粮液股份有限公司，四川宜宾 644000；3.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644000)

浓香型白酒是中国一种传统的白酒类型，也是中国白酒的一个重要品类。它以其独特的风味和浓郁的香气而闻名于世，主要产地是四川、贵州、湖南等地。其主要原料是高粱，采用以小麦制成的大曲为糖化生香剂，通过续糟配料、混蒸混烧、泥窖固态发酵的方式酿造而成。浓香型白酒具有独特的香气和风格特点，其香气主要来源于酒中产生的各类风味物质，例如酯类、醇类、酮类等化合物[1]。浓香型白酒发酵过程中会产生一系列复杂的生化反应，发酵温度、水分、酸度等条件会对发酵产生影响。有研究表明，温度是影响发酵的主要因素之一[2-3]，会对白酒产量与质量、微生物种类与数量与香气成分产生影响。罗冰和张鑫通过研究发现，温度会影响白酒质量[2，4]；张超[5]通过调节发酵过程中升温和降温的速率发现，温度会影响发酵过程中各类微生物的变化；陈丙友[6]发现酒醅温度变化会对清香型白酒酒醅微生物群落生长和代谢产生影响；杜连起[7]通过研究入窖条件与浓香型白酒己酸乙酯的生成量发现，温度对白酒香味物质形成有着重要影响。由此可见，研究发酵温度对浓香型白酒的生产有着重要意义，本试验通过研究温度对白酒酒醅发酵理化性质、有机酸和挥发性风味物质的影响，以期为浓香型白酒酿造提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：酒醅样品由五粮液股份有限公司提供，为入窖酒醅。

试剂及耗材：丙三醇、硫酸铜、葡萄糖、次甲基蓝、盐酸、氢氧化钠、基准苯二甲酸氢钾、盐酸、丙三醇等，均为市售分析纯。

仪器设备：电子天平、酒度计、电热鼓风干燥箱、AVC-4D1 垂直流超净工作台、生化培养箱（BPC-250F），上海一恒科学仪器有限公司；万分之一分析天平（AE200）、色谱仪（Agilent 8890），美国安捷伦科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验方案设计（图1）

图1 实验方案

将从车间取回的入窖酒醅装入已经消毒的塑料罐，每罐装1.7 kg 酒醅，并分为三组放入恒温培养箱,按以下方案进行发酵。

第一组：恒温培养箱起始温度设置为15 ℃，每天升温1 ℃，20 d 后升温至35 ℃，取样为第一阶段；随后在35 ℃下稳定7 d，取样为第二阶段；再每天降温1 ℃，3 d 后降温至32 ℃发酵结束，取样为第三阶段。

第二组：恒温培养箱起始温度设置为20 ℃，每天升温1 ℃，15 d 后升温至35 ℃，取样为第一阶段；随后在35 ℃下稳定7 d，取样为第二阶段；再每天降温1 ℃，3 d 后降温至32 ℃发酵结束，取样为第三阶段。

第三组：恒温培养箱起始温度设置为25 ℃，每天升温1 ℃，10 d 后升温至35 ℃，取样为第一阶段；随后在35 ℃下稳定7 d，取样为第二阶段；再每天降温1 ℃，3 d 后降温至32 ℃发酵结束，取样为第三阶段。

每个阶段取三个平行样品进行后续分析。

1.2.2 理化性质测定

1.2.2.1 水分的检测[8]

称取10 g 均匀酒醅放入烘干至恒重的坩埚，105～110 ℃烘3 h，取出放入干燥器冷却30 min，称量，记为w1。含水量计算公式：f=(10-w1)／10×l00%。

1.2.2.2 酸度的检测[8]

称取均匀酒醅20 g 放入250 mL 烧杯中，加入200 mL 水搅匀，室温浸泡30 min，前15 min 勤搅拌，后15 min 静置。取20 mL 上清液于250 mL 三角瓶，加入25 mL 水，酚酞指示剂2 滴，以0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至微红色为其终点，平行试验滴定允许误差不得超过0.1 mL。

1.2.2.3 淀粉的检测[8]

①水解：称取试样10 g 于250 mL 三角瓶中，加入1∶4 盐酸溶液，轻轻摇动三角瓶，在瓶口装上回流管，于电炉上回流水解30 min，取出，迅速冷却，并用20 %氢氧化钠溶液中和至微酸性，用脱脂棉过滤，滤液定容至250 mL。

②定糖：用斐林试剂滴定糖液，平行试验滴定允许误差不超过0.1 mL。

1.2.2.4 残糖的测定[8]

吸取5 mL 已测酸度的酒醅液于三角瓶中，用斐林试剂滴定，平行试验滴定允许误差不超过0.1 mL，同时做平行空白试验。

1.2.2.5 酒精度的测定

称取酒醅100 g，加入10 %的乙醇200 mL，蒸馏出100 mL的酒样，测定酒精度。

1.2.3 有机酸测定

1.2.3.1 糟醅中有机酸的提取

称取酒醅样品10 g，加入100 mL 30 %的乙醇溶液，置于摇床150 r/min摇30 min，随后静置过夜，然后用0.45 μm滤膜过滤，制成有机酸提取液。

1.2.3.2 有机酸等微量成分的测定

色谱条件：Venusil ASB C18色谱柱（4.6×250 mm×5 μm）；流动相：0.12% H3PO4溶液，0.2 μm 滤膜过滤，流动相流速1 mL/min；检测波长214 nm，柱温箱30 ℃，进样量10 μL。

1.2.3.3 挥发性风味物质检测

称取酒醅100 g，加入10 %的乙醇200 mL，蒸馏出100 mL 的酒样，运用GC-MS 对酒醅中的重要有机酸及醇酯进行分析。

1.2.4 数据处理与分析

使用origin 2021软件作折线图和PCA图。

2 结果与分析

2.1 温度胁迫下不同起始温度酒醅理化性质变化规律

2.1.1 发酵过程中酒醅理化性质随时间的变化规律

不同起始温度下酒醅理化性质随时间的变化规律如图2所示。

图2 不同起始温度下理化性质变化规律

水分在发酵过程中总体呈现先上升后缓慢下降的趋势，起始温度15 ℃和25 ℃水分均在发酵第一阶段达到最大值，分别为60.73%和60.35%。发酵第一阶段水分均快速上升，说明发酵第一阶段淀粉快速下降产生酒精，因此酒醅水分快速增加，发酵第三阶段由于进入酯化期，水分下降，此结果与前人研究结果一致[9]。酸度总体呈现上升趋势，发酵结束后达到最大值。发酵第一阶段酸度缓慢上升，说明此时酵母菌生长代谢旺盛抑制了细菌生长，因此酸度上升缓慢；发酵第二阶段开始，酒醅内细菌开始生长繁殖，因此酸度快速上升。pH 值总体呈现先上升后下降的趋势。淀粉呈现持续下降的趋势，发酵第一阶段快速下降，因此发酵第一阶段水分、酒精度快速上升，此结果与前人的研究结果一致[10]。残糖除起始温度15 ℃的酒醅呈现先下降后上升的趋势外，均呈现持续下降的趋势。酒精度发酵第一阶段快速增长，第二阶段平稳，第三阶段下降。发酵刚开始酒醅内氧气含量丰富，益于酵母菌生长繁殖，此时酒精度迅速上升并达到最高值，随后进入生酸期，产生的酒精与消耗的酒精基本持平，酒精度基本持平，最后进入酯化期，部分酒精用于酯化反应，因此酒精度下降。此结果与前人研究结果一致[11]。

发酵结束后，起始温度15 ℃下残糖、残淀均最高，分别为1.55%、13.07%，酸度最低，为3.34°；起始温度20 ℃下水分和酒精度含量最高，分别为60.1 %、6.83 %vol；起始温度25 ℃下酸度最高，为3.68 °，pH 值、残糖、残淀、酒精度均最低，分别为3.41 °、1.27 %、10.98 %、6.49 %vol。起始温度15 ℃、20 ℃、25 ℃淀粉利用率分别为4.48 %、5.61 %、6.57 %，酒精度增加量分别为4.93 %vol、4.96%vol、4.63%vol，可知起始温度15 ℃下淀粉利用率最高。

2.2 温度胁迫下酒醅有机酸含量变化

有机酸是浓香型白酒的重要呈味物质，乳酸、乙酸、丁酸、己酸在有机酸中占比最高，其总和占有机酸总含量的90 %以上，被称之为四大酸[12]。乳酸、乙酸、丁酸、己酸分别是乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯的前体物质[13-14]。乳酸、乙酸、丁酸、己酸是影响白酒酸度的主要因素。不同起始温度下酒醅有机酸随时间的变化规律如图3所示。

图3 不同起始温度下有机酸变化规律

乳酸在浓香型白酒酒醅酸类物质中含量最高，适量的乳酸可以抑制杂菌生长，调节酸度；过量的乳酸会造成淀粉糖化率低，酒醅残糖高，出酒率低[15]。乳酸可以溶解其他香气成分，具有定香作用，酒中乳酸和乳酸乙酯含量过高会降低酒的放香，使酒体香气淡雅。因此生产过程中应降低乳酸在酒中的含量[16]。发酵过程中乳酸含量在发酵第一阶段下降，在发酵二阶段、三阶段呈上升趋势，这可能是因为发酵第一阶段窖内氧气充足，微生物生长繁殖快，酒醅内能源物质供应不足，乳酸作为反应物被消耗，因此乳酸下降，发酵第二阶段、三阶段酒醅内细菌含量增多，产生大量乳酸，因此乳酸呈现持续上升趋势。此结果与前人研究结果一致[12]。

乙酸是白酒四大酸之一，其主要由醋杆菌生成，具有刺鼻的醋香味，挥发性很强。在白酒呈味有机酸中地位仅次于己酸，乙酸含量高会抑制微生物生长，因此在白酒生产中应将乙酸的含量控制在较低水平[17]。乙酸含量在发酵第一阶段缓慢上升，发酵二阶段、三阶段快速上升。发酵第一阶段酒醅内氧气和营养物质充足，足够醋酸菌生长代谢，醋酸菌作为优势菌种产生乙酸，部分酵母菌在无氧呼吸的情况下生成酒精的同时伴随着乙酸的生成，因此乙酸含量上升。此结果与前人研究结果一致[12]。

丁酸是浓香型白酒中重要的不挥发性有机酸，适量的丁酸使浓香型白酒带有微甜的窖香味，有助于白酒呈味助香；过量的丁酸会使白酒窖泥臭明显，降低白酒品质[18]。丁酸含量在发酵第一阶段呈上升趋势，发酵二阶段、三阶段除起始温度15 ℃的酒醅丁酸呈上升趋势，起始温度20 ℃、25 ℃酒醅丁酸均缓慢下降。发酵进入产酸期后，窖内呈厌氧环境，丁酸菌、异性乳酸菌生长旺盛，这些细菌利用酒醅中的还原糖、乙醇和乙酸等物质生成丁酸，发酵后期由于部分丁酸酯化生成丁酸乙酯，因此丁酸含量下降[15]。

己酸作为己酸乙酯的前体物质，同时也是白酒中一种重要的呈香呈味物质。发酵过程中己酸呈先下降后上升的趋势，均在第一阶段下降到最低值，在第三阶段达到最高值。

起始温度15 ℃发酵结束后，酒醅丁酸含量最高，为246.41 mg/L，乳酸、乙酸、己酸含量最低，分别为5250.74 mg/L、294.90 mg/L、29.09 mg/L。起始温度20 ℃发酵结束后有机酸含量均处于起始温度15 ℃和20 ℃之间。起始温度25 ℃发酵结束后，酒醅乳酸、乙酸、己酸含量最高，分别为5958.57 mg/L、323.71 mg/L、33.88 mg/L，丁酸最低，为233.95 mg/L。发酵结束后，起始温度越高，乳酸含量越高，可能是因为入窖温度高不利于酵母菌充分发酵，导致其快速衰亡，细菌在整个发酵进程中占优势，因此乳酸含量高[12]。

2.3 温度胁迫下酒醅酯类物质含量变化

酯类物质是白酒中一类重要的风味成分，它们组成了白酒的各种香型，其绝对含量占浓香型白酒风味组分第一。不同起始温度下酒醅酯类物质随时间的变化规律如图4所示。

图4 不同起始温度下酯类物质变化规律

乳酸乙酯香气稍弱、微甜，是浓香型白酒重要的呈味物质。发酵过程中乳酸乙酯呈不断上升的趋势，发酵结束后达到最大值，此结果与周新虎研究结果一致[19]。乙酸乙酯主要呈现水果香和甜香，香气稍弱、微甜,是浓香型白酒重要的呈味物质。乙酸乙酯在发酵过程中呈不断上升的趋势，发酵结束后达到最大值。己酸乙酯是判定浓香型白优劣的重要因素，有菠萝的香味和辛辣的味道。己酸乙酯除起始温度为25 ℃的酒醅呈先下降后上升的趋势外，起始温度15 ℃和25 ℃的酒醅己酸乙酯都呈上升趋势，均在发酵结束后达到最大值。

发酵结束时，起始温度15 ℃下己酸乙酯生成量最大，为0.84 mg/100 mL，乳酸乙酯、乙酸乙酯生成量最小，分别为36.25 mg/100 mL、7.80 mg/100 mL；起始温度20 ℃下乙酸乙酯生成量最大，为8.27 mg/100 mL；起始温度25 ℃下乳酸乙酯生成量最大，为49.23 mg/100 mL，己酸乙酯生成量最小，为0.7 mg/100 mL。由结果可知，起始温度15 ℃下，乙酸乙酯生成量最低，己酸乙酯生成量最高，符合浓香型白酒“增己降乳”的行业标准。

2.4 温度胁迫下酒醅醇类物质含量变化

醇类化合物是酒醅中占比最高的一类风味物质，具有沸点低、易挥发、口感刺激的特点。异戊醇、正丙醇、异丁醇和正丁醇是白酒的主要高级醇，适宜浓度的高级醇对白酒风味有重要作用，浓度过高会有异味感[20-21]。不同起始温度下酒醅醇类物质随时间的变化规律如图5所示。

图5 不同起始温度下醇类物质变化规律

发酵过程中甲醇含量呈持续上升的趋势。正丙醇呈先上升再平稳再上升的趋势。正丁醇是白酒中的高级醇，口感苦，含量过高会导致酒体味辣苦涩[22]，除起始温度15 ℃的呈先上升再下降再上升的趋势外，其余入窖温度下酒醅正丁醇含量皆呈上升趋势。异丁醇除起始温度15 ℃呈持续上升的趋势外，其余皆呈先上升再平稳最后上升的趋势；异戊醇除起始温度15 ℃呈现先上升再下降的趋势外，其余起始温度发酵下皆呈先上升再下降再上升的趋势。

发酵结束后，起始温度15 ℃下，正丙醇、异戊醇生成量最大，分别为3.49 mg/100 mL、1.10 mg/100 mL，甲醇生成量最小，为1.05 mg/100 mL；起始温度20 ℃下，异戊醇生成量最大，为3.49 mg/100 mL，正丙醇、正丁醇、异丁醇生成量最低，分别为1.04 mg/100 mL、0.31 mg/100 mL、0.77 mg/100 mL；起始温度25 ℃下，甲醇、正丁醇、异丁醇生成量最大，分别为1.18 mg/100 mL、0.42 mg/100 mL、0.8mg/100 mL，异戊醇生成量最低，为3.33 mg/100 mL。

2.5 理化、有机酸及挥发性风味主成分分析

不同起始温度发酵下，理化、有机酸及风味主成分分析如图6所示。

图6 理化性质、有机酸、风味物质PCA图

如图6 所示，第1 主成分PC1 和第2 主成分PC2可以解释90.4%的原变量信息，3 种发酵温度不同发酵时间的酒醅可以在PCA 双标图的PCA 1 上明显区分。不同发酵阶段下的酒醅样品能明显分开，因此发酵阶段对酒醅有着重要影响。起始温度15 ℃的酒醅与pH 值、丁酸、正丁醇、甲醇、己酸呈正相关；起始温度20 ℃的酒醅与pH 值、己酸、正丁醇、甲醇呈正相关；起始温度25 ℃的酒醅与pH 值、乙酸、己酸乙酯呈正相关。