己酸菌的筛选及其在浓香型白酒生产中应用的研究进展

殷想想，王欣蕊，冯文聪，李 良，陈 晖，董孝元，常 煦，方尚玲，陈茂彬*

（1.湖北工业大学 生物工程与食品学院 工业微生物湖北省重点实验室 发酵工程教育部重点实验室 工业发酵省部共建协同创新中心，湖北 武汉 430068；2.黄鹤楼酒业有限公司，湖北 武汉 430050；3.湖北安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

白酒是中国特有的蒸馏酒，与白兰地、伏特加、威士忌、朗姆酒、金酒并称为世界六大蒸馏酒[1-2]。白酒按照香型分为浓、清、米、酱四种基本香型[3]。其中，浓香型白酒以其“窖香优雅、绵甜爽净、酒体柔和协调”的特点深受消费者喜爱[4]。浓香型白酒是以富含淀粉的谷物为原料如高粱、小麦、糯米、玉米和大米的混合物，以大曲为糖化发酵剂，在栖息于窖池中大量微生物的参与下，自然固态发酵生产[5]。

浓香型白酒发酵过程是在封闭的窖池中进行的，窖池是浓香型白酒形成独特风味的基础。据了解，浓香型白酒的主体香味物质-己酸乙酯，就是由窖池中己酸菌所产己酸和乙醇酯化形成的[6-7]。因此，己酸菌被普遍认为是浓香型白酒酿造过程中最重要的一类功能微生物之一[8]。优良己酸菌有助于窖泥质量和基酒品质的提升。本文对己酸菌的筛选、己酸菌的产酸途径、己酸菌与其他酿酒微生物之间的互作以及己酸菌在浓香型白酒生产中的应用等方面进行综述，以期能够以更加科学的方式将己酸菌应用于生产，提高浓香型白酒的品质。

1 己酸菌的研究情况

1.1 己酸菌筛选

己酸菌是一类能够以乙醇、乳酸、葡萄糖等为碳源，代谢合成己酸的一类微生物的统称。目前，已经从窖泥、牛胃、酒糟等筛选出的产己酸菌株主要包括梭菌属（Clostridium）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、巨球型菌属（Megasphaera）、芽孢杆菌属（Bacillus）等[9-12]，具体信息见表1。

表1 己酸菌的筛选Table 1 Screening of hexanoic acid bacteria

1.2 己酸菌的产酸途径

研究表明，己酸菌主要以乙醇、乳酸、葡萄糖为电子供体通过逆β氧化途径产生己酸[22-25]。己酸合成途径如图1所示。以乙醇为碳源合成己酸一般分为三步：乙醇的氧化、丁酸的形成、己酸的形成。在步骤1中6分子乙醇有1分子氧化为乙酸提供腺苷三磷酸（adenosine-triphosphate，ATP），另外5分子氧化为乙酰辅酶A通过逆β氧化途径参与碳链的延伸，乙醇氧化也为逆β氧化途径提供二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（dihydronicotinamide adenine dinucleotide，NADH）。在步骤2中乙酰辅酶A经过一系列反应生成丁酰辅酶A，然后丁酰辅酶A和乙酸在酰基辅酶A转移酶的作用下生成丁酸。在步骤3中乙酰辅酶A和丁酸结合，碳链进一步延长合成己酸[26]。以乳酸和葡萄糖为碳源合成己酸时，代谢途径可能和以乙醇为底物时类似[27]。

图1 己酸的合成途径Fig.1 Synthesis pathway of hexanoic acid

2 己酸菌与其他微生物间的相互作用

在浓香型白酒生态系统中，微生物种类繁多，己酸菌在浓香型白酒生产中避免不了被其他微生物的生长代谢所影响，因此除了需要研究温度、pH、维生素C（vitamin C，VC）、碳酸钙、乙醇等各种因素对己酸菌生长代谢的影响外[28-29]，还需要探究己酸菌与其他酿酒微生物之间的生长代谢关系，这对己酸菌在浓香型白酒生产中的应用是非常有必要的。

2.1 己酸菌与其他微生物互作的分析方法

在浓香型白酒发酵过程中，参与发酵的微生物种类繁多，己酸菌与其他酿酒微生物之间逐渐形成了竞争或者互利共生关系，微生物之间的相互作用逐渐形成了一个相对稳定的酿酒微生物群落，对提高白酒的品质起着关键的作用。目前，关于浓香型白酒中酿酒微生物的相互作用的研究主要通过气质、气相、高效液相色谱检测发酵液中物质的变化差异，来推测其之间的互作机理，如通过气相色谱测定单菌和混菌发酵液中己酸含量变化，推测它们之间相互促进或抑制。也可以通过高通量测序，分析它们之间的相关性，来确定它们之间是相互促进还是相互抑制。如通过共现网络分析发现梭菌纲（Clostridia）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、甲烷杆菌纲（Methanobacteria）和甲烷微菌纲（Methanomicrobia）之间存在大量显著的正相关或负相关。

2.2 己酸菌与其他酿酒微生物的共培养

2.2.1 己酸菌与酵母菌共培养

研究发现，酿酒酵母与己酸菌共培养可有效促进己酸生产。晋湘宜等[30]筛选了一株葡萄糖抑制性的己酸菌，将己酸菌与酵母菌混合培养时，有助于己酸菌的提前形成，这是因为酿酒酵母和己酸菌混菌培养时，酿酒酵母可以优先利用氧气为己酸菌提供一个厌氧环境，与此同时，酵母菌还可以优先利用葡萄糖，缓解葡萄糖对己酸菌的抑制作用。嵇翔等[31]同样将克氏梭菌8022与酿酒酵母进行了混合培养，不仅缩短了发酵周期而且己酸产量从6.35 g/L提高至7.09 g/L，分析是由于酿酒酵母的存在为己酸菌的生长提供了厌氧环境，提高了己酸菌从乙酸到己酸的转化速率。通过酿酒酵母与己酸菌的共培养初步探究出酵母菌促进己酸菌生长代谢可能是由于酿酒酵母对氧气的消耗以及生长代谢所产生的乙醇可以为己酸菌生长代谢提供适量碳源造成的。

2.2.2 己酸菌与乳酸菌共培养

魏翠翠等[32]研究发现，瘤胃菌（CPB6）能高效利用乳酸生产己酸，但其利用葡萄糖生产己酸能力较差，增加了发酵成本。采用CPB6与植物乳杆菌（RJ25）共培养，两种菌共培养时利用葡萄糖生产己酸17.794 g/L，是CPB6单菌种利用葡萄糖生产己酸（7.726 g/L）的2.3倍，己酸生产效率由21.77%提升至48.37%。这是因为当以乳酸为碳源的产己菌与乳酸菌共培养时，乳杆菌（RJ25）可以以葡萄糖为碳源生成乳酸为瘤胃菌（CPB6）产己酸提供碳源。ZHU X Y等[17]从中国浓香型白酒生态系统中富集到了一种独特的微生物组，该微生物组以乳酸为碳源生产己酸。该发酵微生物组可以利用乳酸生成高达23.41 g/L己酸，比目前任何单一纯化己酸菌株产量都要高，这一结果再一次证明了多菌种混合发酵对己酸菌的产量是有益的。

2.2.3 己酸菌与互营球菌共培养

孙红等[33]为了研究浓香型白酒生态系统中主要功能菌的相互作用，将互营球菌（N.902）与梭菌（C.901）共培养，结果表明，互营球菌（N.902）对梭菌（C.901）的生长和代谢具有显著促进作用，共培养过程中除了葡萄糖的消耗量增加，生物量增加外，C.90l的丁酸和己酸积累量分别增加0.44和0.63倍左右。据研究发现互营球菌（N.902）的产物为乙酸和乙醇，乙酸和乙醇都可以作为梭菌（C.901）逆β逆氧化途径的底物，这可能是互营球菌（N.902）促进梭菌（C.901）提高己酸的主要原因。

2.2.4 不同来源己酸菌的共培养

来源不同的浓香型白酒窖泥中己酸菌的种类和特点各不相同，人们对它们之间的相互关系了解不多，因此对不同来源的己酸菌进行互作探究对己酸菌产酸的提升是有意义的。赵德义等[34]将不同来源己酸菌分别进行单独和混菌培养，第10天测定己酸含量发现，己酸菌单独发酵最高产量2 930.4 mg/L，比它们混合培养时己酸的产量3 365.6 mg/L要低。这表明将不同来源的己酸菌菌液混合培养可以促进不同窖泥微生物之间相互作用从而促进己酸菌的生长和代谢。

2.2.5 己酸菌与放线菌的共培养

郭威等[35-36]通过筛选，从窖泥中筛选获得一株优良放线菌GW01，与己酸菌混合培养发酵比己酸菌纯种发酵产酸量提高约31%。经研究发现，放线菌能够提高己酸菌产酸量与放线菌所产黑色素有关，黑色素对己酸菌代谢的促进机理，这一结果可能和马荣山[37]研究发现，在白酒发酵过程中添加适量维生素C（vitamin C，VC）可以提高己酸产量的机理是相同的。栾兴社等[38]同样也发现了一种链霉菌与己酸菌共培养时，对己酸菌产己酸具有促进作用，且该菌具有较强的利用硫和硫化物的能力，提高了酒品质并为窖泥脱臭提供了新的生物技术。这表明，不同类型的放线菌所产生的一些物质可能对己酸菌产量的提高有不同的影响。因此，研究己酸菌与放线菌之间的相互关系，对提高浓香型白酒品质具有一定的意义。

2.2.6 己酸菌与丁酸菌的共培养

丁酸菌和己酸菌是提供浓香型白酒主要风味物质的两种功能微生物，对浓香型白酒品质起着关键的作用，因此，探究丁酸菌与己酸菌的相互作用及机理是非常有必要的。万朕等[39]研究发现，将己酸菌与丁酸菌以1∶1的配比共培养时，己酸菌的己酸产量提高50%左右。丁酸是己酸菌合成己酸的前体物质，己酸菌发酵时添加适当的丁酸菌，可以为己酸菌提供一定量的丁酸作为合成己酸的前体物质，从而使己酸菌的代谢产量提高。

3 己酸菌在浓香型白酒生产中的应用

3.1 在窖泥中的应用

窖泥质量关系着浓香型白酒的质量，窖泥中的微生物是产生白酒中风味酯的关键前体物质。天然窖泥的成熟时间超过20年，而且窖池在生产发酵过程中会导致窖池中的营养物质逐渐减少，微生物代谢所产生的有害物质逐渐增加，使窖池中的有益微生物数量减少，从而导致酿造出来的浓香型白酒风味不够、口感欠佳。随着人们对窖泥中微生物群落变化的研究，分析并筛选出了窖泥中优势菌属-己酸菌，促使人们将己酸菌应用于人工窖泥的构建、窖池的养护等方面[40-42]。

3.1.1 在人工窖泥中的应用

人工窖泥的构建大部分是将分离出的己酸菌菌液加入窖泥、黄土、老窖泥、曲粉等中，并按照一定配比混合[43]。鲁少文等[44]将以乳酸为碳源的瘤胃科梭菌（CPC-11）制作人工窖泥，并投入生产发酵35 d，在21 d时己酸含量达到最高，比初始含量提高了1.2倍，在35 d时己酸乙酯含量比初始含量提高了2.74倍。马玉磊等[45]通过向人工窖泥中添加己酸菌液，使人工窖泥中己酸乙酯的含量最终为0.5 mg/g干土，有效的提高了窖泥的品质。路振华[43]将己酸菌培养液和酯化红曲加入人工窖泥中，用以提高浓香型白酒品质。综上所述，在人工窖泥制作中加入己酸菌，可以使己酸菌快速形成优势菌群，加速人工窖池老熟，从而提高浓香型白酒中己酸乙酯含量。人工窖泥构建工艺流程如下：

3.1.2 在养窖护窖中的应用

张家庆[46]将实验室制备的己酸菌液、酯化液黄水等按照一定比例配制窖池养护液，密封培养5 d后应用于退化窖池，酒质分析结果表明，养护后的退化窖池所产酒质的己酸乙酯、总酸、总酯相对养护前提升比例分别为42.7%、16.2%、37.5%。王鑫[47]通过前期恢复生产的窖池及新启用的窖池两方面分析，用己酸菌液泼洒窖池，对窖池窖泥进行养护，且得到较好成效。在保证出酒率正常，优级酒率提高的同时，该厂全年特级酒产率平均达10%以上（己酸乙酯350 mg/mL），研究获得圆满成功。杨月轮[48]将菌株SLXJNR3-1制备成菌液后，在窖池中应用，可以有效地提高窖泥中产己酸菌的数量水平，促进酿造过程中己酸、丁酸等的生成。徐敬征等[49]确定了最佳比例为己酸菌液30%，丙酸菌液30%，丁酸菌液20%，优质窖泥培菌液20%。实践证明，通过向退化窖池中加入功能己酸菌液对窖泥进行微生态的养护效果是可行的。

3.2 己酸菌在新型白酒中的应用

“千年老窖万年糟，好酒全凭窖池老”，这句话充分体现了窖池在浓香型白酒中的重要性。老窖虽好，但是也存在着一定缺陷，就是窖池的成熟期太长，这严重影响力浓香型白酒的发展。现如今，随着科技的发展，人们发现己酸菌是窖池中主要的微生物，是生成己酸乙酯的主体微生物。

研究发现己酸乙酯是浓香型白酒中的主体香味物质，以己酸菌发酵液和乙醇为底物，在酯化酶的作用下生成己酸乙酯发酵液[50]，将其运用到无窖泥浓香型曲酒生产中，对提高白酒品质，降低生产成本，提高生产效率，具有一定的生产和实际应用价值。任静[51]通过一系列的实验确立了己酸菌酯化条件，得到效果与优质浓香型白酒的四大酯比例相仿的酯化液。四大酯比例为已酸乙酯∶乳酸乙酯∶乙酸乙酯∶丁酸乙酯=1∶0.78∶0.63∶0.08，将酯化液应用于新型白酒的生产，代替勾兑白酒的香精香料成分，改善和提高曲酒的品质，降低生产成本，有较强的生产实际应用价值。

4 结论与展望

己酸菌是浓香型白酒中最重要的功能微生物之一，对提高浓香型白酒的品质起着至关重要的作用。目前将筛选到的己酸菌主要用于人工窖泥的生产、窖池的养护、己酸菌发酵液的酯化等方面提高浓香型白酒品质。但是也存在己酸乙酯提高不足，白酒品质改善不明显的问题，主要原因可能在于所筛选己酸菌产酸性不高、对氧气的耐受性不好、易被其他微生物生长代谢所影响等。

在浓香型白酒生产过程中微生物种类繁多，己酸菌不可避免会被其他微生物的生长代谢所影响，研究己酸菌与其他酿酒微生物之间的生长代谢关系，是提高己酸产量的关键。

综上所述，为了提升浓香型白酒品质、提高生产效率、降低生产成本，可采取以下措施：①利用微生物之间的相互作用，筛选厌氧性较好的高产己酸菌。②将筛选到产己酸较高的厌氧菌株与窖泥中其他对浓香型白酒的功能微生物共培养，探究出它们之间相互促进或抑制的机理，用于提高己酸产量。③将与己酸菌互作促进产己酸的复合己酸菌液应用到浓香型白酒人工窖池的构建、窖池的养窖护窖中以期在短时间内改善窖泥质量，以期在短时间内提高浓香型白酒品质，降低生产成本。④将高产己酸菌复合菌液或复合己酸菌发酵液酯化后应用到新型无窖泥生产浓香型白酒中，用以提升己酸乙酯含量和白酒品质，降低生产成本，提高白酒产量。