美乐桃红贵腐葡萄酒的酿造及感官特征分析

屈嘉燕，周润宇，缪成鹏，王群力，张晓红，高邦牢，江理广，惠竹梅，4*，王雪飞，4*

(1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌 712100；2.山西戎子酒庄有限公司，山西乡宁 042100；3.福建蓝家渡酒庄有限公司，福建上杭 364200；4.陕西葡萄与葡萄酒工程中心，陕西杨凌 712100)

贵腐葡萄酒又称“液体黄金”，是用灰霉菌侵染的成熟葡萄果实酿造而成的高端甜型葡萄酒，其香气复杂浓郁、口感甜美、风味独特，具有较高的产品附加价值[1-2]。贵腐葡萄原料产生的自然条件较为苛刻，需在温差较大的河流交会山谷处产生，且感染时机难以控制。世界上的自然贵腐酒大多数产自欧洲[3]，著名的贵腐酒有法国波尔多产区的苏玳（Sauternes）、匈牙利托卡伊（Tokaji）产区的奥苏（Aszú）、德国精选干甜葡萄特级优质酒（Trockenbeerenausless）等[4]。

在灰霉菌成功侵染葡萄果实后，早上潮湿的气候有利于灰霉菌生长，中午过后的干热天气使得葡萄果实中的水分从侵染的小孔处蒸发。在这种独特的条件下，葡萄浆果逐渐干缩，糖、酸和香气物质等也得到进一步浓缩[5-6]，最终赋予新鲜葡萄酒柑橘和干果风味，赋予陈年葡萄酒橘皮风味并伴有蜂蜜或者蜡状的特征[7]。由于自然贵腐作用对气候条件要求苛刻，且除欧洲传统的优质贵腐酒产区外，世界上其他的葡萄酒产区很难发生自然贵腐作用[8]，这极大的提高了贵腐酒的生产和酿造成本，限制了贵腐酒的产量和消费市场，导致其难以成为大众消费品。

针对自然贵腐酒对气候条件的高要求、酿造的高成本以及潜在的市场需求，人工贵腐酒的酿造方法得以研究并取得了一定进展。Sivertsen 等[9]和Magyar 等[10]在成熟或采摘后的葡萄果实表面人工喷洒灰霉菌孢子悬液获得两种人工贵腐葡萄原料。Tosi 等[11]将新采摘的葡萄依次进行人工灰霉菌孢子悬液喷洒处理和干化处理，最后对所酿葡萄酒进行香气分析，发现灰霉菌的侵染水平和葡萄的干化程度对贵腐酒中挥发性物质的影响较大，灰霉菌的侵染和干化过程使葡萄酒中酯类、内酯类、萜烯类、C13-去甲类、异戊二烯类、醛酮类和酚类物质等总量增加，且经灰霉菌感染后葡萄汁的酯酶活性升高，贵腐酒中酯类物质的总含量降低。陶永胜等[12]采用人工接种葡萄果实和葡萄汁的方法来酿造贵腐酒，结果表明使用人工贵腐葡萄和人工贵腐葡萄汁所酿酒中的高级醇质量浓度较小，人工贵腐葡萄所酿酒中含有γ-癸内酯、苯乙酸和2-壬酮等特殊香气物质，人工贵腐葡萄汁所酿酒的香气更为复杂和典型，具有明显的焦糖、甜杏、芒果、烘烤等特征。

我国葡萄酒产品以干型酒为主，甜型酒较少，贵腐葡萄酒极少且未能实现批量生产[8，13]，人工贵腐酒生产在我国具有良好的发展前景。从现有研究来看，前人研究主要集中于人工贵腐葡萄酒的酿造过程及其品质特征分析，未有研究桃红贵腐葡萄酒产品的报道。因此，本研究在总结前人的研究成果上加以创新，采用人工接种灰霉菌孢子悬液的方式制备贵腐葡萄果实，结合酿造工艺的技术要点进行小容器酿造，通过理化指标检测、香气成分分析和感官品鉴，评价桃红贵腐葡萄酒的品质特征与酿造工艺的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料菌种：健康和自然贵腐的“美乐”（Merlot）葡萄于2021 年9 月采自山西戎子酒庄葡萄园，采后立刻运回实验室进行处理；灰霉菌（Botrytis cinerea）保藏于西北农林科技大学葡萄酒学院。

PDA 培养基[12]：土豆汁质量分数20 %、葡萄糖质量分数1.6%、琼脂粉质量分数2%、硫酸镁质量分数0.05%、磷酸二氢钾质量分数0.1%。

仪器设备：GC/MS-QP2020 型气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；安东帕Lyza 5000 葡萄酒分析仪，奥地利安东帕公司。

1.2 实验方法

1.2.1 灰霉菌孢子悬液的制备

灰霉菌孢子悬液的制备参考陶永胜等[14]的方法，略作修改。具体方法为：将灰霉菌在PDA 培养基上培养14 d，用牙签挑取菌丝于50 mL离心管中，加入20 mL 无菌水，8000 r/min 涡旋1 min，随后用4层纱布过滤，将滤液转入新的50 mL 离心管中，使用血球细胞计数板进行计数，稀释至孢子终浓度为106cfu/mL。最后在滤液中加入9 g/L氯化钠、10 g/L蔗糖和0.01%吐温-80配制成灰霉菌孢子悬液。

1.2.2 贵腐葡萄果实的制备

葡萄果实离体接种参考兰圆圆[3]方法，略作修改。采集健康、成熟度良好的美乐葡萄果实，均匀喷洒75 %的酒精于表面进行消毒，重复三次。晾干后，将制备好的灰霉菌孢子悬液喷洒在葡萄果穗表面，随后将果穗装入感湿培育袋中，设置培养箱温度24 ℃±2 ℃，湿度75 %，培养至喷施灰霉菌孢子悬液的葡萄果实表面均匀长满灰霉菌丝。对获得的葡萄果实进行逐穗挑选，去除干瘪果粒，将果穗平铺于托盘中，40 ℃烘箱中烘至失水率30%～40%，含糖量达270～290 g/L。

对照处理中健康的葡萄果实采用9 g/L 氯化钠、10 g/L 蔗糖和0.01 %吐温-80 配制成的无菌溶液喷施，其余步骤同上。对照组处理果实用于酿造美乐甜红葡萄酒。

美乐自然贵腐酒的葡萄果实采摘于山西戎子酒庄葡萄园。

1.2.3 小容器酿造

采用5 L 广口玻璃瓶进行发酵和贮藏，参照牛见明等[15]、王超萍等[1]和杜娟等[16]方法，略作修改。将烘干处理后的葡萄果实迅速除梗破碎、入罐，加入80 mg/L SO2，2 h 后加入20 mg/L 果胶酶（Lallemand EX-V），15～18 ℃浸渍发酵24 h 后接出自流酒，皮渣帽压榨取汁。随后接种2%活化后的酿酒酵母（Lalvin D254），控温在15～18 ℃进行发酵，当比重降至1.050 左右时，加入60 mg/L SO2，满罐密封转移至4 ℃静置沉淀。20 d 后，加入1 g/L 经活化的膨润土，再次满罐密封，4 ℃静置，20 d 后虹吸出上层酒液加入100 mg/L 山梨酸钾满罐密封，4 ℃长期保存。

1.2.4 葡萄酒理化指标检测

使用安东帕Lyza 5000 葡萄酒分析仪进行葡萄酒基本理化指标的检测，所测指标包括乙醇、总糖、葡萄糖、果糖、可滴定酸、蔗糖、丙三醇、挥发酸、酒石酸、总多酚、苹果酸、乳酸、葡萄糖酸、pH值、密度、固形物。

1.2.5 香气成分检测

参考陶永胜等[12]的方法，采用固相微萃取结合气相色谱-质谱联用法进行香气化合物分析。

香气成分萃取：使用DVB/CAR/PDMS 萃取纤维（50/30 µm 涂层厚度，2 cm，可伸缩长度）进行香气成分萃取。在装有磁力搅拌子的20 mL 顶空瓶中加入8 mL 酒样、2 g NaCl 和50 µL 内标液（0.4 mg/L，2-辛醇），启动搅拌子，在40 ℃水浴中稳定10 min，随后用萃取头吸附40 min，将萃取头放入GC进样口热解析5 min。

GC-MS 分析条件：样品注射体积为1µL，不分流进样，氦气（纯度99.999 %）为载气，氦气流速为1 mL/min。柱升温程序：3 ℃/min从40 ℃升至130 ℃，再以4 ℃/min从130 ℃升至250 ℃，保持8 min。连接杆温度为230 ℃，进样口温度为250 ℃，离子源温度为250 ℃。质谱采用电子源电离轰击，扫描范围为33～450 u，扫描速率0.2 次/s，电子源电压为70 eV，灯丝流量为0.20 mA，检测器电压为350 V。

定性定量分析：采用样品质谱与标准品质谱对比、样品的保留时间与标准品的保留时间对比，结合NIST 17 谱库查询进行香气化合物的定性分析，采用内标-标准曲线法进行香气化合物的定量分析。以2-辛醇为内标物质，采用五点法绘制标准曲线。

1.2.6 感官量化评价

葡萄酒感官量化分析采用Tao 等[17]的方法，略作修改。评价小组由30名经培训人员组成，品尝前进行标准味感物质和香气物质训练。品尝时一次分析3 款酒样，取适量酒样于品尝杯中，以其色泽、气味、口感为评价指标，采用5 点标度法对感知的感官特征量化。

1.3 数据处理

所得实验数据结果采用SPSS 26.0 软件进行单因素方差分析和多重比较（Duncan 新复极差法，P ＜0.05），利用Origin pro 2021绘图。

2 结果与分析

2.1 人工贵腐果实的制备

人工接种侵染的美乐葡萄果实在感染初期果面发病不明显，果梗上可见少量菌丝（图1），感染中期部分果实表面产生菌丝，感染后期大部分果穗感染明显，果实表面布满菌丝和孢子。经烘箱40 ℃处理后，果穗明显皱缩，体积变小。

图1 人工接种后葡萄果实的贵腐化过程

2.2 不同桃红贵腐葡萄酒的基础理化指标

理化指标是评价葡萄酒质量的基本依据，受葡萄品种、生长环境、葡萄酒酿造及陈酿工艺的影响[18]，主要包括酒精度、总糖、挥发酸等。从所得结果来看（表1），三款酒样的乙醇含量为13.07%vol～14.14%vol，在乙醇和密度方面没有明显差异；自然贵腐酒和人工贵腐酒的基本理化指标较为接近。从自然贵腐酒与人工贵腐酒的对比来看，自然贵腐酒在可滴定酸含量上高于人工贵腐酒，其余指标上两者之间没有明显差异。

表1 不同酒样的基础理化指标

前人研究发现成熟的葡萄果实在被灰霉菌侵染后，由于灰霉菌的生长代谢作用会使得葡萄果实的成分发生变化，其中葡萄糖酸含量会升高，酒石酸含量会下降[13，19]，但也有学者[20]研究发现灰霉菌感染对葡萄酒中酒石酸和苹果酸的含量没有显著影响。从本实验结果来看（表2），自然贵腐酒和人工贵腐酒的葡萄糖酸含量显著高于对照酒样，自然贵腐酒的酒石酸含量显著高于对照酒样。

表2 不同酒样中酸的含量

酒样糖含量如表3 所示，自然贵腐酒与人工贵腐酒之间无明显差异，与对照酒样之间差异显著。在总糖含量上，美乐甜红葡萄酒（对照）达到了半甜葡萄酒的标准，自然贵腐酒与人工贵腐酒均达到了甜型葡萄酒的标准。

表3 不同酒样中糖的含量 (g/L)

2.3 不同桃红贵腐葡萄酒的香气组分分析

葡萄酒挥发性香气成分的分析在葡萄酒质量和特征方面起到了决定性作用[21]。从单个香气成分实际气味贡献来看，用气味活度值（odour activity value，OAV）表示葡萄酒中各香气化合物对主体香气成分的贡献是目前使用较多的方法，当OAV＞1 时，该香气化合物对葡萄酒香气起直接作用，当OAV＜1 时，嗅觉器官对此化合物的气味无明显感觉[22-23]。

Blanco-ulate 等[24]研究发现贵腐菌的感染会对赛美容葡萄果实的发育及代谢活动产生影响，会使葡萄果实的花色苷、萜烯类物质及脂肪酸香气前体物质的生物合成明显升高。从所得实验结果来看，在酯类物质方面，自然贵腐酒和人工贵腐酒中的乙酸乙酯含量高于美乐甜红葡萄酒，这与陶永胜等[12]的研究结果相符，可能是由于灰霉菌的侵染使得葡萄汁中乙酸浓度较高，最终使葡萄酒中乙酸乙酯含量较高；在醇类物质方面，三个酒样中1-戊醇、苯乙醇和3-甲硫基丙醇在含量方面差异不显著，而苯乙醇被认为是美乐葡萄品种的特征香气物质[18]；在酸类物质方面，人工贵腐酒在醋酸含量上低于自然贵腐酒，在辛酸含量上显著高于自然贵腐酒，使得人工贵腐酒与自然贵腐酒相比醋味较淡、涩味稍重，在其他香气成分上，自然贵腐酒中的壬醛含量高于另外两个酒样，这是因为相比于醇类或者酯类物质，醛类物质在植物抵抗真菌的侵染方面发挥重要作用[25]，导致灰霉菌侵染后的葡萄果实酿造的葡萄酒中醛类物质增多。

在关于贵腐酒香气物质的研究中，有学者研究发现发酵过程中硫醇的含量对贵腐酒的香气有一定影响[7]，3-巯基己醇主要贡献酒中的柑橘味[26]。也有学者研究发现δ-内酯类和γ-内酯类对贵腐酒香气有显著影响[27-28]。Genovese等[29]和Sivertsen等[9]研究发现贵腐酒在蜂蜜、杏仁、杏和成熟花朵等香气描述词汇上得分更高，而蜂蜜、干无花果和杏仁等香气被认为是贵腐甜酒的典型香气。在贵腐葡萄酒的特征香气物质方面，本研究所得到的人工贵腐酒与自然贵腐酒虽然存在差异，但从所得结果来看（表4），人工贵腐酒具有花香、柠檬味、苦杏仁味等和贵腐葡萄酒相关的香气特征[6]。

表4 不同酒样的香气分析

2.4 不同桃红贵腐酒的感官品鉴

葡萄酒的感官评价是指通过眼、口、鼻、舌等感觉器官从颜色、气味、口感等方面对葡萄酒进行综合评价[39]。将三个酒样的感官品鉴结果进行PCA 分析（图2），发现第一主成分贡献率为38.7 %，第二成分贡献率为31.9 %，累计贡献率为70.6 %。通过主成分分析图可以发现自然贵腐酒与人工贵腐酒之间差异较小，主要为蜂蜜、杏仁、烤面包以及山楂花等香气，而美乐甜红葡萄酒（对照）与前两个酒样之间存在着显著差异，表明人工贵腐酒的香气更接近于自然贵腐酒，具有一定程度的贵腐葡萄酒香气特征。

图2 不同酒样的感官品鉴主成分分析

3 结论

本研究借鉴前人的研究成果，采用人工离体接种灰霉菌的方式，结合桃红葡萄酒和贵腐葡萄酒的酿造工艺，酿造得到桃红贵腐葡萄酒。所得的人工贵腐酒各项理化指标更接近于自然贵腐葡萄酒，且人工贵腐酒和自然贵腐酒在糖含量上均达到了甜型葡萄酒的标准；在香气成分和感官品鉴上，人工贵腐酒接近于自然贵腐酒，具有花香、杏仁、柠檬、奶油以及山楂花等香气。本研究中的人工桃红贵腐葡萄酒兼具了桃红葡萄酒的活跃果香与贵腐葡萄酒的甜润口感和浓郁香气，表明了人工桃红贵腐葡萄酒酿造技术具有可行性。