?抑制变形杆菌的干酪乳杆菌LDJ主要抑菌物质分析?

许丽娟 吴海雁 喻孟元 高帅帅 王玉梅 吴民熙 王震 吴迎奔

摘要： 干酪乳桿菌LDJ是一株能抑制变形杆菌生长的优良菌株。为了探究干酪乳杆菌LDJ无细胞上清液的抑菌效果，采用牛津杯法测定了不同培养时间的无细胞上清液对变形杆菌的抑菌能力，发酵时间在0～4 h时无细胞上清液无抑菌能力，发酵至8 h时抑菌能力逐步上升，发酵时间在24～48 h时无细胞上清液抑菌能力趋于平稳；其中，发酵时间在36 h时，抑菌圈直径最大，为20.48 mm。干酪乳杆菌LDJ无细胞上清液中抑菌物质的理化特性研究结果表明：该抑菌物质对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和李斯特菌都有不同程度的抑制作用；无细胞上清液经40～100℃处理30 min，仍有良好的抑菌活性；pH值在3～6范围内抑菌物质有良好的抑菌效果，在中性及碱性条件下则没有抑菌作用；不同酶处理对无细胞上清液的抑菌效果有不同程度的影响。因此，推测其抑菌有效成分可能为肽类及有机酸。

关键词： 干酪乳杆菌；变形杆菌；抑菌活性；抑菌物质

中图分类号：S182文献标识码：A文章编号：1006-060X（2024）02-0006-04

Inhibition of Proteusbacillus vulgaris by Main Antibacterial Substances in Lactobacillus casei LDJ

XU Li-juan1，3，WU Hai-yan2，3，YU Meng-yuan1，3，GAO Shuai-shuai1，3，WANG Yu-mei2，3，

WU Min-xi1，3，WANG Zhen1，3，WU Ying-ben1，3

（1. Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC; 2. Hunan Kemeijie Environmental Science and Technology Co.， Ltd.， Changsha 410000， PRC; 3. Changsha Center for Innovation in Bio-Disinfection and Deodorization Technology， Changsha 410000， PRC）

Abstract： Lactobacillus casei LDJ is an excellent strain that can inhibit the growth of Proteusbacillus vulgaris. To investigate the antibacterial effect of the cell-free supernatant of Lactobacillus casei LDJ， the antibacterial ability of cell-free supernatant with different fermentation time on Proteusbacillus vulgaris was tested by the Oxford cup method. When the fermentation time was 0–4 h， the cell-free supernatant had no antibacterial ability. The antibacterial ability increased gradually after fermentation of 8 h and tended to be stable when fermentation time was 24–48 h. Specifically， when the fermentation time was 36 h， the diameter of the antibacterial zone was the largest （20.48 mm）. The research on physicochemical properties of the antibacterial substances in the cell-free supernatant of Lactobacillus casei LDJ shows that the antibacterial substance has various inhibitory effects on Escherichia coli， Staphylococcus aureus， and Listeria monocytogenes. The cell-free supernatant still has good antibacterial activity after treatment at 40–100℃ for 30 min. The antibacterial substance has a good antibacterial effect in the range of pH value 3–6 but shows no antibacterial effect under neutral and alkaline conditions. Different enzyme treatments have different effects on the antibacterial effect of cell-free supernatant. Therefore， it is speculated that the effective antibacterial components of Lactobacillus casei LDJ may be peptides and organic acids.

Key words： Lactobacillus casei; Proteusbacillus vulgaris; antibacterial activity; antibacterial substance

变形杆菌是革兰氏阴性菌，形态多变，有杆状、球杆状、丝状等，无芽孢、无荚膜、有鞭毛、好运动[1]，在自然界分布广泛，土壤、水、垃圾、腐烂有机物及人或动物的肠道内均有分布[2]。变形杆菌是鱼类特定腐败菌之一[3]，也可寄生于人体肠道，当机体抵抗力下降时可引起尿路感染、呼吸道感染、腹膜炎、胃肠炎等，对人类健康造成影响[4]。

乳酸菌是一类可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称[5]。乳酸菌在发酵过程中产生如乳酸、乙酸等有机酸[6]、有抑菌作用的蛋白质[7]或多肽类[8]等物质。有研究人员认为，乳酸菌产酸降低了生长环境的pH值，从而不利于沙门氏菌、布氏杆菌等有害菌的生长[9]；马欢欢等[10]研究发现，植物乳杆菌产生的乙酸和乳酸共同对黑曲霉起抑菌作用；陆春波等[9]研究发现，植物乳杆菌DY6的主要抑菌物质为有机酸和脂肪酸；李宏伟等[11]分析得出，乳杆菌抑制猪霍乱沙门氏菌的有效成分为小肽类或有机酸亦或其共同作用。

课题组前期分离纯化了一株对变形杆菌有抑制作用的干酪乳杆菌LDJ，该研究以其发酵液为研究对象，将发酵液制备成无细胞上清液，然后研究其对变形杆菌的抑制作用，并初步分析了干酪乳杆菌LDJ发酵液中抑菌物质的理化特性，为探明干酪乳杆菌LDJ对变形杆菌的抑菌成分提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 干酪乳杆菌LDJ（Lactobacillus

casei LDJ）由湖南省微生物研究院实验室分离获得；变形杆菌1.1651购于中国科学院微生物菌种保藏中心；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌由湖南省微生物研究院菌种保藏中心提供。

1.1.2 培养基 （1）营养肉汤培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，加水至1 L，pH值7.4±0.2，加15.0 g琼脂为固体培养基，121℃灭菌20 min。（2）MRS培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、酵母粉4.0 g、葡萄糖2.0 g、吐温80 1.0 mL、磷酸氢二钾2.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g，加水至1 L，调pH值6.5±0.2，加15.0 g琼脂为固体培养基，121℃灭菌20 min。

1.1.3 主要设备和仪器 生化培养箱（LRH-400A，广东泰宏君科学仪器股份有限公司）；洁净工作台（SW-CJ-2F，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）； 雷磁pH计（PHS-3E型， 上海仪电科仪）；台式高速冷冻离心机（KH30R-Ⅱ，湖南凯达科学仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（DK-S26型，上每森信实验仪器有限公司）；美菱冰箱（BCD-249CF，合肥美菱股份有限公司）；电热鼓风干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；立式压力蒸汽灭菌器（BXM-30R，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；紫外可见分光光度计（TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 干酪乳杆菌LDJ无细胞上清液的制备 将保存于-80℃的干酪乳杆菌LDJ活化后，再将其按3%的接种量接于MRS培养基中，37±2℃培养48 h后，取菌液于无菌EP管中，10 000 r/min离心30 min，再用0.22 μm的滤膜过滤，得无细胞上清液，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 干酪乳杆菌LDJ无细胞上清液的抑菌试验 首先将营养肉汤固体培养基倒入无菌培养皿中，待其凝固后，加入100 μL的变形杆菌菌液并涂布均匀，然后用镊子将无菌牛津杯置于凝固的培养基上，再往牛津杯中加入干酪乳杆菌无细胞上清液200 μL，平行加入卡那毒素于另外的牛津杯中作为阳性对照，加入已灭菌MRS培养基的牛津杯为阴性对照，于37℃下培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.2.3 不同培养时间无细胞上清液的抑菌活性研究 将活化后的干酪乳杆菌按3%的接种量接到200 mL的MRS培养基中，37±2℃培养，分别在0、4、8、12、16、20、24、30、36、48 h取5 mL发酵液，测定其OD600值； 然后参照1.2.1的方法制成无细胞上清液，再参照1.2.2的方法测定每个时间段对变形杆菌的抑菌活性。

1.2.4 干酪乳杆菌LDJ抑菌物质的理化特性研究 （1）抑菌物质稳定性研究：将干酪乳杆菌无细胞上清液分别在40、60、80、100℃条件下处理30 min[8]，测定不同处理后的样品对变形杆菌的抑制作用。用1.0 mol/L的HCl和NaOH将无细胞上清液调至pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0并保持1 h，比较经过不同处理的样品对变形杆菌的抑制情况。（2）酶处理对抑菌物质的影响：将无细胞上清液pH值调至各酶的最适pH值，胃蛋白酶pH 2.0、胰蛋白酶pH 7.0和蛋白酶K pH 7.5，分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K，使其终质量浓度均为1.0 g/L，在各自最适的温度下反应1 h后，沸水浴3 min灭酶，冷却后将pH值调回至无细胞上清液初始pH值，以未经酶处理的无细胞上清液为对照，采用牛津杯法测定其抑菌圈直径[9]。每个处理重复3次。

1.2.5 抑菌物质的抑菌活性 （1）抑菌物质稀释倍数试验：将干酪乳杆菌LDJ无细胞上清液用紫外分光光度计在600 nm处测定其吸光度值，并调整OD值为1，然后采用倍数稀释法将无细胞上清液分别稀释为2、4、8倍，用牛津杯法，将上述稀释液分别对变形杆菌进行抑菌试验，考察抑菌物质的最大稀释倍数。每个处理重复3次。（2）抑菌广谱性分析：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌按1%的接種量分别接于100 mL的营养肉汤培养基中，37±2℃培养24 h后，再参照1.2.2进行抑菌试验。每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 不同培养时间的抑菌情况

从图1可知，无细胞上清液的抑菌效果与其菌体的生长情况呈正相关。干酪乳杆菌LDJ接种8 h后开始进入对数期，到24 h后生长趋于平稳。发酵0～4 h的无细胞上清液对变形杆菌没有抑制作用，发酵8 h后抑菌效果明显提高，抑菌直径为10.33 mm；发酵24 h时，抑菌圈直径达20.11 mm，发酵36 h时抑菌圈直径最大，为20.48 mm。从图1中还可看出，随着发酵时间的延长，抑菌圈直径也随之增加。这是因为随着菌体的增加，发酵液中抑菌物质的种类和含量也随之增加，因此抑菌作用增强，抑菌圈直径增大；但当菌体数量达到平衡状态时，抑菌物质的含量也保持稳定，因此抑菌作用不再增强，抑菌圈直径也不再增加。

2.2 抑菌物质的理化特性

2.2.1 热稳定性 从图2可知，无细胞上清液经40、60、80、100℃处理30 min后，与CK相比，抑菌活性未发生显著变化，表明无細胞上清液中的抑菌物质有良好的热稳定性。

2.2.2 pH值稳定性 由表1可知，随着pH值的升高，发酵液中抑菌物质的抑菌活性逐渐降低，当pH值为7及以上时，抑菌活性完全消失。因此，干酪乳杆菌LDJ无细胞上清液中的抑菌物质在pH值3.0～5.0范围内抑菌活性较强，而在中性和碱性条件下没有抑菌活性。可能是因为在碱性条件下，蛋白质在分子间静电相互作用下诱导氨基和羧基的解离，导致蛋白质变性丢失了抑菌活性。这与吕欣然[12]的研究结果一致。

2.3 酶处理对抑菌物质的影响

试验结果表明，CK和胃蛋白酶的抑菌圈直径分别为20.58±0.05 和8.05±0.63 mm，说明经胃蛋白酶处理后，抑菌活性部分丧失，而经胰蛋白酶、蛋白酶K处理后，抑菌活性完全消失。这说明干酪乳杆菌无细胞上清液中的抑菌活性物质有蛋白类或肽类物质。

2.4 抑菌物质的抑菌活性

2.4.1 抑菌物质的稀释倍数对抑菌活性的影响 试验结果表明，抑菌物质的稀释倍数为0、2、4倍时，抑菌圈直径分别为20.49±0.18、18.22±0.17、11.38±0.15 mm，说明干酪乳杆菌LDJ无细胞上清液的抑菌能力随着稀释倍数的增大而降低，无细胞上清液稀释4倍时，抑菌圈直径与原液抑菌圈直径相比小了近一半。而稀释8倍时，抑菌圈直径为0，抑菌活性完全消失。

2.4.2 抑菌谱 干酪乳杆菌LDJ无细胞上清液除了对变形杆菌有抑制作用外，还对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌进行了抑菌试验，结果如表2、图3所示，干酪乳杆菌LDJ无细胞上清液对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有不同程度的抑制作用。这表明干酪乳杆菌LDJ产生的是一类具有广谱抑菌活性的抑菌物质。

3 结论

变形杆菌是一种人畜共患病原体，为条件致病菌，变形杆菌中毒是最常见的食物中毒类型[13]，而且它还是垃圾中主要的致腐微生物之一，能分解垃圾中的含氮有机物产生氨气散发至周围空气

中[14-15]。因此，变形杆菌具有危害人体健康和污染环境等多重风险。

干酪乳杆菌LDJ是从环境中分离得到的一株土著安全高效的降氨微生物，其无细胞上清液能抑制变形杆菌的生长，除此之外，还对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌均有很好的抑制作用，而且上清液中的抑菌物质有良好的热稳定性，在酸性条件下抑菌效果好。经不同酶处理后，抑菌活性部分丧失或完全消失。综合试验结果，说明干酪乳杆菌无细胞上清液中的抑菌活性物质可能为有机酸类和蛋白类或肽类物质。

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（责任编辑：张焕裕）