HPLC-RID法测定不同厂家益母草药材中盐酸水苏碱含量?

王秋萍 杨邦祝 宋善敏 甘梦兰 李满香 何珺 雷阳（81）

摘要：建立了测定益母草中盐酸水苏碱含量的HPLC-RID方法，并测定分析了14家药厂的益母草中盐酸水苏碱的含量。结果表明：以Mercury益母草专用柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以70%乙腈溶液为流动相、流速1.0 mL/min、柱温45℃的条件下采用示差检测器进行检测，盐酸水苏碱在0.100～0.523 mg/mL浓度范围内呈良好的线性关系；回归方程为y=91 519 x+1 342.2 （R2=0.991 6），平均回收率100.07 %，RSD为0.71 %，且该方法具有重复性好、操作简便、快速、稳定、易于普及等优点；各厂家的益母草药材中盐酸水苏碱含量差异较大，14家厂家中仅有1367和8656这2家的益母草药材符合药典标准；盐酸水苏碱含量与益母草药材性状具有关联性，市民、药企和中药商等在购买益母草药材时，建议选择性状为叶多、青绿、茎细的益母草药材。

关键词： 益母草；盐酸水苏碱； HPLC-RID；不同厂家；药材性状

中图分类号：S567.2; R917文献标识码：A文章编号：1006-060X（2024）02-0081-04

Determination of Stachydrine Hydrochloride in Leonuri Herba from Different

Manufacturers by HPLC-RID

WANG Qiu-ping1，2，YANG Bang-zhu1，SONG Shan-min1，GAN Meng-lan1，LI Man-xiang1，HE Jun2，LEI Yang1

（1. Guizhou Vocational College of Agriculture， Qingzhen 551400， PRC;

2. Guizhou Provincial Biochemical Engineering Center， Guizhou University， Guiyang 550025， PRC）

Abstract： A HPLC-RID method was established to determine the content of stachydrine hydrochloride in Leonuri Herba， and then the content of stachydrine hydrochloride in the Leonuri Herba samples from 14 manufacturers was determined. The results indicated that the content of stachydrine hydrochloride demonstrated a good linear relationship within the range of 0.100–0.523 mg/mL using the differential detector with the Mercury column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm）， mobile phase of 70：30 acetonitrile-water solution， flow rate of 1.0 mL/min， and column temperature of 45℃. The regression equation was y=91 519 x+1 342.2 （R2=0.991 6）， and the average recovery rate was 100.07% （RSD of 0.71%）. The established HPLC-RID method was characterized by good repeatability， simple operation， rapid determination with stable results， and easy popularization. The content of stachydrine hydrochloride varied significantly among samples from different manufacturers， and only the samples from manufacturers 1367 and 8656 met the standards in the Chinese Pharmacopoeia. The content of stachydrine hydrochloride was associated with the medicinal characteristics of Leonuri Herba. According to the results， we suggested that users， pharmaceutical enterprises， and Chinese medicine manufacturers chose the Leonuri Herba materials with rich green leaves and fine stems.

Key words： Leonuri Herba; stachydrine hydrochloride; HPLC-RID; different manufacturers; medicinal characteristics

益母草（Leonurus japonicus Houtt.）為唇形科益母草属植物的新鲜或干燥地上部分，别名益母艾、野麻、坤草等，全国大部分地区均有种植[1]。益母草中主要有效成分为益母草碱和盐酸水苏碱[2]。药理作用研究表明，益母草中的生物碱具有显著的兴奋子宫、镇痛抗炎、改善血液流变学、抗血栓等多种药理活性[3-5]，为治疗月经不调、胎漏难产、产后恶露不尽、瘀血腹痛等妇科病及抗心肌缺血临床治疗的常用良药[6-8]。目前市面上以益母草为单一原料制成有糖型或无糖型益母草颗粒的国药准字号厂家多达185家，益母草原药材中盐酸水苏碱的含量检测是益母草颗粒生产中的必要步骤。由于各厂家生产的益母草颗粒中盐酸水苏碱含量的差异，临床和药理试验发现，有病人在服用常规或过量益母草药材后，人体出现过敏、腹泻等不良反应，有的甚至出现严重的肝、肾等脏器损伤[9-12]。因此，益母草药材质量的把控至关重要，而高效快捷的盐酸水苏碱检测技术也显得尤为迫切。目前，用于测定益母草中盐酸水苏碱含量的方法有HPLC-UV法、HPLC-ELSD法、HPLC-MS法、HPLC-DAD法等[13-16]，它们大多仪器昂贵、操作繁杂、维护较难，不便于在中小型企业中普及应用。因此，亟需建立一种操作简便、快速、稳定、易于普及的方法，以便各类型药企普及益母草药材中盐酸水苏碱的检测。

市售的益母草药材中盐酸水苏碱含量常常存在较大差异，与药企、中医院等具有检测仪器相比，普通市民在购买益母草药材时很难确定其有效成分含量。而盐酸水苏碱含量往往与益母草药材性状具有很大的关联，分析不同厂家益母草药材性状与盐酸水苏碱含量的关系，可为市民、药企和中药商购买益母草药材提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要仪器 1100 系列分析型HPLC[安捷伦科技（中国）有限公司]，Mercury益母草专用柱（大连依利特分析仪器有限公司），BSA124S电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；其他为一般常规仪器。

1.1.2 试药与试剂 盐酸水苏碱对照品（100%，批号122683，中国食品药品检定研究院），益母草药材（贵阳市太升中药材市场的诚信、启源、惠源等14家中药厂家，用厂家老板的手机尾号后4位作为该药材的代号），乙腈（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；其他为常规试剂（分析纯）。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Mercury益母草专用柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相为70%乙腈溶液；流速1.0 mL/min；柱温45℃；示差检测器，进样量10 μL，样品上机前过0.45 μm微孔滤膜。

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的对照品适量，加70%乙醇制成含盐酸水苏碱0.100 mg/mL的溶液，摇匀备用。

1.2.3 供试品溶液制备 参照2015版《中华人民共和国药典》[12]制备，样品置于70℃烘箱烘至恒重，粉碎过40目筛，以八分法对角取样。称取样品粉末约1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精准加入70%乙醇25 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失重量，摇匀过滤备用。

1.2.4 方法学考察 （1）专属性试验：取对照品、供试品溶液进行测定，记录色谱图。（2）线性关系考察：精密称取干燥至恒重的对照品适量，加70%乙醇制成盐酸水苏碱浓度分别为0.100、0.201、0.300、0.402、0.523 mg/mL的溶液，摇匀，按1.2.1色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图。以盐酸水苏碱的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行回归分析。（3）重复性试验：取同一批样品6份，按1.2.3配制供试品溶液，按1.2.1色谱条件进行测定，根据测定值计算RSD。（4）稳定性试验：按1.2.3配置供试品溶液，静置0、2、4、6、8、10、12 h后分别进行测定，记录色谱图，根据测定值计算RSD。（5）精密度试验：精密吸取对照品溶液，连续测定6次，记录色谱图，按测定值计算RSD。（6）回收率试验：精密称取益母草粉末2 g，按1.2.3方法制成待测样品，取6份样品，其中：2份精密加入0.273 mg/mL的盐酸水苏碱1 mL；2份精密加入0.341 mg/mL的盐酸水苏碱1 mL；2份精密加入0.409 mg/mL的盐酸水苏碱1 mL。按1.2.1色谱条件分别测定，记录色谱图，计算平均回收率和RSD值。

1.2.5 不同厂家益母草药材中盐酸水苏碱含量的测定 按1.2.3的方法处理14个厂家的4批次益母草药材，配制成供试品溶液，按1.2.1色谱条件分别进行测定，计算各厂家各批次药材的盐酸水苏碱含量。

1.3 数據处理

采用Excel 2007软件对数据进行整理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 对照品及样品的HPLC图谱

分别取对照品溶液、供试品溶液进行HPLC分析，色谱图如图1所示，盐酸水苏碱的出峰时间约为11 min，峰型完整，无干扰。

2.2 方法学考察结果

2.2.1 线性关系考察 回归方程为y=91 519 x+1 342.2，

R2为0.991 6，表明建立的回归方程相关性良好。此外，回归方程的线性范围为0.100～0.523 mg/mL。

2.2.2 重复性试验 盐酸水苏碱含量为0.66%，其RSD值为0.23%，表明该检测方法的重复性良好。

2.2.3 稳定性试验 盐酸水苏碱含量为0.66%，其RSD值为0.29%，表明12 h内供试品溶液稳定性良好。

2.2.4 精密度试验 由表1可知，盐酸水苏碱的平均加样回收率为100.07 %，RSD为0.71 %，表明该检测方法的精密度良好。

2.3 不同厂家益母草药材中盐酸水苏碱含量测定

由表2可知，益母草药材中盐酸水苏碱含量最高的是厂家1367，达0.824%，其药材性状为叶多、叶绿、茎细；其次为厂家8656，盐酸水苏碱含量达0.679%，其药材性状为叶多、青绿、茎细。益母草药材中盐酸水苏碱含量在0.30%～0.50%的厂家有5083、8299、4368、3606、1458，其药材性状大多为色青绿或略黄、茎略多或茎粗。益母草药材中盐酸水苏碱含量在0.30%以下的厂家有5918、6813、7947、4636、2356、2768、2501，其药材性状大多为茎多叶少、叶色略黄、茎粗。2015版《中华人民共国药典》规定：益母草药材按干燥品计算，其盐酸水苏碱（C7H13NO2·HCl）含量不得少于0.50 %[15]，表明仅有厂家1367和8656的益母草药材符合药典标准。因此，市民、药企和中药商等在购买益母草药材时，应选择性状为叶多、青绿、茎细的益母草药材。

2.4 符合标准药材复检

从符合标准的2厂家购买大批量益母草药材，复检其益母草药材中盐酸水苏碱含量分别为0.66% 和0.79%，均大于0.50%的要求。

3 小结与讨论

益母草中盐酸水苏碱属于强极性的酸碱两性小分子化合物，反相色谱柱较难将其分离，常用的C18柱也较难将其分离[13]。该研究采用的正向酰胺柱具有良好的分离效果，克服了以上不足。

该研究所用样品上机前均过0.45 μm微孔滤膜处理，可较好地保护色谱柱及仪器，同时也可减少污染或杂质对测定结果的影响。

李伟等[13]报道的益母草原药材盐酸水苏碱的检测方法为HPLC-ELSD（蒸发光散射检测器），使用该方法需要有较高的飘移管温度和一定的载气体积流量，耗时耗能耗材。周超等[14]采用HPLC-MS法同时测定益母草及益母草颗粒中盐酸水苏碱及益母草碱含量时，流动相需要梯度洗脱分流进入质谱仪，对柱温、毛细管电压、探头温度、锥孔电压、定量离子等都有一定的要求，仪器价格较贵、操作繁杂、不易普及；该研究建立的HPLC-RID法测定益母草中盐酸水苏碱含量与前人研究已报道的HPLC-ELSD[13]、HPLC-MS[14]、HPLC-UV[15]、HPLC-DAD[16]法相比，具有重复性好、操作简便、快速、稳定、易于普及等优点，可满足一般药企对益母草药材的质量控制。

该研究对市场上不同厂家益母草药材中盐酸水苏碱含量进行检测，结果发现，各厂家的益母草药材中盐酸水苏碱含量差异较大，14家厂家中仅有1367和8656这2家的益母草药材符合药典标准。此外，盐酸水苏碱的含量与益母草药材性状有较大关联度，盐酸水苏碱含量较高的益母草药材性状大多为叶多、青绿、茎细，含量较低的益母草药材性状大多为茎多叶少、叶色略黄、茎粗。因此，市民、药企和中药商等在购买益母草药材时，应选择性状为叶多、青绿、茎细的益母草药材。

参考文献：

[1] 俞捷，王璟，赵荣华，等. 益母草肾脏不良反应研究进展[J]. 中国中药杂志，2010，35（9）：1213-1216.

[2] 李存玉，馬赟，刘奕洲，等. 超滤-纳滤联用优化益母草生物碱的浓缩工艺[J]. 中国中药杂志，2017，42（1）：100-106.

[3] 谢晓芳，陈俊仁，李刚敏，等. 益母草对子宫的药理作用研究进展[J]. 世界中医药，2020，15（9）：1263-1266.

[4] 代良萍，董艳红，胡婷婷，等. 水苏碱药理作用研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志，2016，22（19）：189-193.

[5] 乔晶晶，吴啟南，薛敏，等. 益母草化学成分与药理作用研究进展[J]. 中草药，2018，49（23）：5691-5704.

[6] 王丽娟，张丽，王勇，等. 益母草镇痛抗炎作用的实验研究[J]. 时珍国医国药，2009，20（3）：645-646.

[7] 魏丽春，李庆军. 益母草的药理与临床研究进展[J]. 西北药学杂志，2009，24（4）：333-335.

[8] 崔展. 益母草颗粒抗心肌缺血的临床研究[J]. 中国继续医学教育，2017，9（17）：190-192.

[9] 孙蓉，冯群，赵庆华，等. 益母草毒性研究进展[J]. 中国药物警戒，2014，11（2）：70-73.

[10] 黄伟，孙蓉，张作平. 益母草不同炮制品的小鼠急性毒性实验研究[J]. 中国药物警戒，2010，7（2）：65-69.

[11] 于华芸，季旭明. 益母草的毒性毒理研究概况[J]. 湖南中医杂志，2008，24（2）：112-113.

[12] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典-四部（2015年版）[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015.

[13] 李伟，张建军，王小花，等. HPLC-ELSD测定益母草颗粒中盐酸水苏碱的含量[J]. 中国实验方剂学杂志，2018，24（23）：100-103.

[14] 周超，张聿梅，何轶，等. HPLC-MS法同时测定益母草及其颗粒剂中盐酸水苏碱与盐酸益母草碱的含量[J]. 药物分析杂志，2016，36（5）：830-834.

[15] 包小红，周娟，伍丕娥. HPLC法测定4种益母草制剂中盐酸水苏碱及其标准方法评价[J]. 中成药，2012，34（9）：1825-1828.

[16] 伍涛，肖裕章，李成洪，等. HPLC-DAD法测定益母草颗粒中盐酸水苏碱含量的方法[J]. 甘肃农业大学学报，2020，55（3）：23-28， 37.

（责任编辑：张焕裕）