?山银花中酚类物质提取工艺优化及其成分初鉴?

高炜 李浪 余莲芳 丁慧娟 丁胜华

摘要： 以自然干燥山银花为原料，采用超声波辅助乙醇溶剂提取法，通过单因素试验，结合响应面对山银花多酚的提取工艺进行优化，并用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）基于植物广泛靶向数据库对其多酚物质进行定性定量初鉴。结果表明，山银花总酚提取量的最佳工艺条件为：料（g）液（mL）比10∶1，乙醇浓度57%，超声功率70 W，提取温度60℃，提取时间11 min，此条件下山银花总酚提取量为71.08 mg/g；山银花酚酸以绿原酸同分异构体为主，黄酮以川陈皮素、木犀草苷和香叶木苷为主。

关键词： 山银花；总酚；超高效液相色谱串联质谱；响应面法；酚类物质

中图分类号：R282.71; R284.1文献标识码：A文章编号：1006-060X（2024）02-0074-07

Optimization of Extraction Process and Preliminary Component Identification of Phenolic Substances from Lonicerae flos

GAO Wei1，LI Lang2，YU Lian-fang3，DING Hui-juan3，DING Sheng-hua1

（1. Agricultural Product Processing Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC; 2. Yueyang Academy of Agricultural Sciences， Yueyang Branch Center of New Plant Varieties Testing of Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

Yueyang 414000， PRC; 3. Yueyang Inspection and Testing Center， Yueyang 414000， PRC）

Abstract： The natural dry Lonicerae flos was used as raw material. Ultrasonic-assisted ethanol solvent extraction method was adopted to optimize the extraction process of polyphenols from Lonicerae flos through a single factor experiment combined with the response surface method， and UPLC-MS/MS was utilized to conduct a preliminary qualitative and quantitative identification of its phenolic substances based on the plant's extensive target database. The results show that the optimal process conditions for the extraction of total phenols from Lonicerae flos are as follows： solid-liquid ratio of 10∶1 g/mL， ethanol concentration of 57%， ultrasonic power of 70 W， extraction temperature at 60°C， and extraction time of 11 min. The amount of extracted total phenols from Lonicerae flos is 71.08 mg/g; the phenolic acid of Lonicerae flos is mainly chlorogenic acid isomers， and the flavonoids are mainly tangerine， luteolin， and diosmin.

Key words： Lonicerae flos; total phenols; UPLC-MS/MS; response surface method; phenolic substances

根據2020年版《中国药典》，山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬、红腺忍冬、华南忍冬或黄褐毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花。湖南山银花主栽品种为灰毡毛忍冬，其花呈棒状而稍弯曲，花梗集结成簇，花冠裂片，外观黄色或黄绿色，又名五彩山银花。山银花主要含有酚酸、黄酮类等化合物[1]，已有研究表明酚类物质具有抗菌[2]、抗氧化[3-4]、提高免疫力等作用[5]。因此，山银花被用作药材，具有清热解毒、疏散风热等功效[6-7]。湖南隆回是山银花种植、加工和集散地，实现了道地药材产业融合，打造了“湘九味”药材品牌。

目前，国内外专家对山银花中总黄酮、总酚酸、绿原酸进行了深入研究，如Duan等[8]研究了萃取法对山银花酚酸提取率的影响；Yang等[9]研究了近红外光谱监测山银花提取过程中成分的变化；史颖珠等[10]建立了山银花中5种黄酮苷液相色谱/质谱检测法，Wu [11]、刘秀敏[12]和郝梦超[13]等结合微波或超声波等辅助提取，可高效提取山银花中活性成分。同时，刘欣等[14]还研究分析了水提法、醇提法、酶解法、超声波法和微波法等提取山银花中绿原酸的差异，综合评价了不同提取方法的优劣，认为超声波法提取率高，处理时间短，比微波提取法更为普遍。同时，山银花的提取工艺研究多集中对单一对象指标的优化、抗氧化能力评价、不同产地山银花成分含量对比、检测方法的建立，未对山银花提取物成分组成进行深入研究。如李洁等[15]优化了山银花总酚酸提取工艺为：提取时间50 min，固液比1∶50，超声波功率300 W，绿原酸提取率达到88.8 mg/g；周峰等[16]初步鉴定山银花甲醇提取物中有机酸和皂苷类成分可能是山银花具抗炎、抗氧化活性的主要物质基础。肖作为等[17]研究了不同产地山银花中绿原酸、总黄酮的提取工艺为：提取温度65℃，超声提取30 min，绿原酸用60％乙醇溶液，料液比1∶20提取，总黄酮用60％甲醇溶液，料液比1∶10提取；Zhang等[18]采用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱筛选鉴定了山银花中绿原酸；史颖珠等[19]采用液相色谱-串联质谱法建立了山银花中14种黄酮类化合物的测定方法。总酚包括了所有酚类物质，植物广泛靶向代谢组学数据库也是近年许多学者关注的热点，该数据库整理建立了超过5 800种酚类物质的检测、鉴定的质谱参数。然而，基于植物广泛靶向数据库对山银花多酚物质的研究鲜有报道。因此，笔者对山银花总酚提取工艺进行响应面法优化，并基于UPLC-MS/MS和植物广泛靶向数据库对其多酚物质进行定性定量初鉴，以其为高值化利用山银花活性物提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山银花原材料：购自湖南隆回县小沙江镇。甲醇、乙腈（色谱纯）：美国默克（Merck）公司；无水乙醇（分析纯）：郑州派尼化学试剂厂；Folin酚：合肥博美生物有限公司；无水碳酸钠：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机：FW-100型，北京市永光明医疗仪器有限公司；数控超声波清洗器：KQ-700DE型，昆山市超声仪器有限公司；Avanti J-26XP冷冻离心机：美国Beckman公司； UV-1800紫外可见分光光度计：岛津仪器（苏州）有限公司；ExionLC? AD型超高效液相色谱串联质谱仪（配电喷雾离子源ESI）：美国SCIEX公司。

1.3 试验方法

1.3.1 提取液的制备 将去杂后的山银花自然晾干，在粉碎机中粉碎过60目筛收集样品。精确称取样品1.0 g于50 mL离心管，按料液比加入适量浓度的乙醇，在固定提取时间内，控制好提取温度，在一定功率的超声波辅助下提取，离心收集上清液。重复提取2次，合并上清液后，再用60%乙醇定容至50 mL，涡旋离心，0.22 μm滤膜过滤，用于总酚的测定。取提取液200 μL，加入200 μL 60%乙醇内标提取液，涡旋离心，0.22 μm滤膜过滤，用于酚類物质检测。

1.3.2 总酚的测定 总酚：采用Folin-Ciocalteus[20]法。取提取液0.4 mL，加入2 mL稀释10倍的Folin酚试剂后混合均匀，5 min后加入10%的碳酸钠溶液3 mL，混合均匀常温放置1 h，于765 nm处测定吸光值，以60%乙醇为对照。样品中的总酚提取量以每克干重含没食子酸当量表示（mg/g）。

1.3.3 单因素试验 按1.3.1试验操作，分别对影响超声波辅助提取山银花总酚过程中的5个因素料液比、乙醇浓度、超声功率、提取温度和时间进行单因素试验，具体见表1。

1.3.4 响应面试验设计 在5 种单因素试验基础上，以料液比、乙醇浓度、超声功率和提取时间为自变因素，进行四因素三水平L9（34）的正交试验，结合Design-Expert软件中Box-Behnken中心组合试验设计原理，得出山银花总酚提取量的最佳工艺条件，响应面试验因素水平见表2。

1.3.5 酚类物质的测定 基于植物广泛靶向数据库鉴定和定量的新集成方法测定[21-22]。色谱参数：色谱柱：Agilent SB-C18 1.8 ?m，2.1 mm×100 mm；流动相：A相为超纯水（加入0.1%的甲酸），B相为乙腈（加入0.1%的甲酸）；梯度洗脱程序（见表3）；流速0.35 mL/min；柱温40℃；进样量2 μL。质谱参数：离子源：电喷雾离子源（ESI）温度500℃；扫描模式：正负离子扫描；监测方式：多反应监测（MRM）；离子喷雾电压（IS）5500 V（正离子模式）/-4500 V（负离子模式）；去簇电压（DP）和碰撞能（CE）进一步优化，完成各个MRM离子对的DP和CE。

1.4 数据统计与处理

采用Excel 软件统计分析试验数据，计算标准偏差。单因素显著性分析，采用t检验，当P＜0.05时，表示差异显著，最后用Origin 8软件作图。响应面试验设计，采用Design Expert V 8.0.6软件处理分析数据；对回归方程进行显著性分析，*表示显著（P＜0.05），**表示极显著（P＜0.01），***表示高度显著（P＜0.000 1）。

2 结果与分析

2.1 单因素对山银花总酚提取量的影响

由图1可知，当单因素变量料（g）液（mL）比10∶1，提取时间10 min，乙醇浓度60%，超声功率70 W，提取温度60℃时，山银花总酚提取量均最高，分别为66.66、70.28、67.64、65.85、66.59 mg/g。料液比、提取时间或乙醇浓度低于或高于其条件时，总酚提取量均呈现显著性下降趋势，直至趋于稳定。这说明溶剂用量过少、提取时间短、乙醇浓度低不利于总酚充分溶解，过多溶剂用量、提取时间长、乙醇浓度高可能会提取出杂质，破坏总酚物质结构、降低总酚浓度，从而影响总酚的提取[7-8，15]。设备超声功率限值100 W，在低于功率70 W时总酚提取量呈现显著性提高，高于功率70 W时总酚提取量变化不显著，可能是超声辅助提取总酚既有增加样品与溶剂接触的正作用，又有破坏总酚物质结构的负作用[6-7]。设备温度限值80℃，在低于50℃时总酚提取量呈现极显著性提高，高于50℃时总酚提取量变化不显著。有研究表明物质的溶解度与温度呈正相关，在达到一定温度后，溶解度趋于稳定[17]；再有设备控温不精准，仅单因素试验结果60℃作为总酚提取量的最佳工艺条件。

2.2 响应面试验设计结果、显著性及交互作用分析

通过表4中的总酚提取量进行响应面回归分析，可知回归方程：Y= 71.989+0.931A-0.301B+0.172C+0.564D+2.705AB+0.317AC+1.969AD-0.364BC-1.814BD-0.194CD-3.22A2-0.783B2-2.029C2-3.033D2。

对回归方程进行显著性分析（见表5），得出此回归方程P＜0.000 1，高度显著，失拟P值为0.792 7＞

0.05，不显著。且该模型总决定系数R2=0.995 6，调整决定系数R2adj=0.991 2。综上结果，说明了该模型拟合度好，误差小，可以用此回归方程对试验数据进行分析和预测。由F值可知，各因素对总酚提取量的影响依次为：A＞D＞B＞C。由表5还可得出，模型中因素A、D均为高度显著，因素B为极显著，因素C为显著，且二次项AB、AD、BD、A2、B2、C2、D2均为高度显著；BC为极显著；AC为显著。这说明各个因素对总酚提取量的影响并非简单的线性关系[15]。

从图2中响应面图可以明显看出两两因素交互作用对总酚提取量的显著性影响。其中AB、AD和BD响应曲面向下弯曲程度大、坡度陡，BC和AC次之，表明两两因素交互作用对总酚提取量的影響比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；CD两两因素交互作用对总酚提取量的影响比较差异无统计学意义（P＞0.05），这与周珠法[23]研究分析的交互作用显著性一致。

结合Design-Expert 12 软件分析结果与实验室条件验证最佳工艺条件如下：料液比10∶1（mL/g），乙醇浓度57%，超声功率70 W，提取时间11 min，结果表明山银花总酚提取量平均为71.08 mg/g，与理论值72.14 mg/g相对误差为1.47%<5%，说明构建的模型是有效的。

2.3 山银花酚类物质初步鉴定

图3A为负离子模式下混样质控样品质谱分析总离子流图，图3B为正离子模式下多物质提取的离子流谱图，共检测到775个酚酸和黄酮类物质，物质鉴定匹配得分为0.7分以上有195个，取相对含量峰面积前24个物质信息列出（见表5）。从表5可以得出，异绿原酸B、隐绿原酸、绿原酸、新绿原酸、川陈皮素 、木犀草苷、香叶木苷、咖啡酸、桔皮素、异绿原酸C等提取物与宋伟峰等[24]、Cai 等[25]、Zhang等[18]、Zhang [26]和史颖珠等[10]研究中绿原酸、异绿原酸、新绿原酸、木犀草苷、咖啡酸等成分基本一致。该次相对含量峰面积不能决定物质含量高低，与物质响应强度、仪器参数等因素有关，还与提取中酚类物质本身代谢能力的差异性有关，但都可以说明其是山银花提取的主要成分[21，27]。利用响应面法优化，超声辅助提取山银花多酚酸、黄酮类物质与吴寒秋[27]和姚桃女[1]等研究的提取方法和检测成分结果相当，山银花提取液中酚酸以绿原酸同分异构体为主，黄酮以川陈皮素、木犀草苷和香叶木苷为主；二咖啡酰基莽草酸等提取物与Zhao等[28]鉴定山银花中成分构成同分异构体；其他物质成分初鉴结果及相对含量的差异可能与基于植物广泛靶向数据库的不同而略有不同[29]。同时研究结果也表明，山银花提取物在负离子模式下扫描监视比正离子模式要更有广泛靶向性。

3 结论

通过单因素试验，结合响应面优化山银花多酚的提取工艺，最佳工艺条件如下：料液比10∶1 （mL/g），

乙醇浓度57%，提取温度60℃，超声功率70 W，提取时间11 min，结果表明山银花总酚提取量平均为71.08 mg/g，与理论值相对误差为1.47%<5%，说明构建的模型是有效的。UPLC-MS/MS定性定量初鉴共检测到775个酚酸和黄酮类物质，物质鉴定匹配得分为0.7分以上有195个，主要是异绿原酸B、二咖啡酰基莽草酸、隐绿原酸、绿原酸、棕矢车菊素-7-O-葡萄糖苷、鸢尾甲苷A、新绿原酸、5，7，4'-三羟基-6，8-二甲氧基异黄酮-7-O-半乳糖苷、高车前素-7-O-葡萄糖苷、香叶木素-7-O-半乳糖苷、甲基山柰酚-3-O-葡萄糖苷、川陈皮素 、木犀草苷、香叶木苷、邻苯二甲酸酐、咖啡酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸甲酯、桔皮素、异绿原酸C、苜蓿素-7-O-新橙皮糖苷、依兰酚酸、洋蓟酸、香叶木素-7-O-新橘皮糖苷、3'，4'，5'，5，7-五甲氧基黄酮等物质。同时研究结果也表明，山银花提取物在负离子模式下扫描监视比正离子模式要更有广泛靶向性，这也为进一步高值化利用山银花提了供理论依据。

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（责任编辑：张焕裕）