男性不育患者精液质量与精浆微量元素水平及精浆外泌体miR-184水平的关系

陈甫 刘斌 和帅军 赵勇 王伟周

中国人民解放军总医院第六医学中心妇产科 （北京 100037）

男性不育问题在现代社会越来越普遍，影响众多夫妇生育健康，了解男性不育患者精液质量及其与其他因素之间的关系，对于找到潜在治疗方法和预防策略至关重要。根据世界卫生组织（WHO）标准，育龄期夫妇有正常性生活超过1 年且没有任何避孕措施，在排除女方不孕问题情况下，由于男方原因导致女方未能怀孕称为男性不育［1］。有研究表示［2］，微量元素虽在人体体内含量较少，但对其各种生物学功能十分重要，微量元素摄入过量、缺乏等均会在一定程度上导致人体生理异常或疾病发生。近年大量研究表明［3］，精液质量是评估男性生育能力的重要指标，精浆微量元素与精子质量联系密切，其可通过参与男性生殖系统多种酶的构成与激活，促进其合成性激素，进而通过精子发生、成熟等方式影响男性生殖系统的生理功能。外泌体（exosome）作为新型液体活检指标，广泛存在于人体多种体液中，与疾病发生、发展联系密切，可通过运输脂质、miRNA、蛋白质等信号分子进入受体细胞，并作用于受体细胞的靶基因中，影响其功能，参与多种生理、病理过程。而生殖细胞分泌外泌体可携带miRNA 进入到受体细胞中，调控其基因表达，导致人体细胞功能改变以及生殖系统相关疾病的发生与发展［4］。生物信息学分析发现，miR-184 靶基因富集于男性生殖系统的发育中，其细胞间相互作用、细胞分化等与男性生殖、精子产生密切相关。此外，miR-184 作为miRNA 家族主要的成员，在人体中相应转录本分子量通常为84 bp，而成熟的miR-184 表达于男性睾丸组织中，其在精子发生过程中发挥着关键的生理功能，与男性不育联系密切［5］。但目前关于微量元素水平、miR-184 表达与男性不育关系报道较少，因此本研究通过探讨男性不育患者精液质量与精浆微量元素水平及精浆外泌体中miR-184 水平的关系，为之后临床治疗该类疾病提供医学参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取本院2022 年1 月至2023 年7月收治的155 例男性不育患者为不育组，另选取同期155 名体检正常者为正常组。两组一般资料比较差异无统计学意义（P> 0.05），具有可比性，见表1。本次研究开始前经医院伦理委员会批准（伦理批号：2021-02 号）。

表1 两组一般资料比较Tab.1 Comparison of general information between two groups ±s

组别不育组（n = 155）正常组（n = 155）t值P值年龄（岁）28.11±3.35 27.95±3.64 0.403 0.688体质量指数（BMI）（kg/m2）25.95±2.26 26.11±2.02 0.657 0.512体质量（kg）79.89±6.56 80.11±6.34 0.300 0.764腰围（cm）92.16±8.56 91.89±8.76 0.274 0.784

1.2 纳入标准（1）不育组符合《男性生殖遗传学检查专家共识》［6］中不育症诊断标准，正常组为健康男性；（2）不育组为性生活正常，未行避孕措施1年以上无法生育，且排除女方不孕问题，因男方因素导致女方不育者；（3）两组均签署知情同意书。

1.3 排除标准（1）存在泌尿道手术史；（2）存在生殖感染史；（3）家族存在男性生殖功能相关疾病史；（4）研究前6 个月应用过抗心律失常、溶栓药物、免疫抑制剂等影响本研究结果药物；（5）合并心、肝、肾等脏器异常者；（6）认知、精神功能异常者；（7）合并射精管疾病、前列腺等影响测量精液体积的疾病。

1.4 方法（1）精液质量参数：①标本采集：嘱禁欲3～7 d，自慰法取精液置于无菌容器中，存于37 ℃温育30 min，等待完全液化。②精液质量检测：严格参考WHO《人类精液检查与处理实验室手册》［7］进行操作，等待精液完全液化后，使用CASA全自动精子分析仪（西班牙MICROPTIC 公司）检测精子密度、精子总活力（PR+NP）、前向运动精子（PR）、精子平均曲线运动速度、精子平均直线运动速度、精子平均路径运动速度、精子头部侧向平均振幅（ALH）。（2）精浆微量元素水平检测：精液采集2 h 内，使用离心机（SIGMA 公司，型号：3-15）以3 000 r/min 转速，离心10 min，去除精子细胞获得精浆，采用原子吸收分光光度仪（潍坊华盛医疗器械有限公司，型号：SK6880 型）检测精浆中锌（Zn）、铜（Cu）、镁（Mg）、钙（Ca）、铁（Fe）、铅（Pb）水平。（3）精浆外泌体中miR-184 相对表达量检测：①精浆外泌体提取与鉴定：获得精浆方式同（2），然后按照ExoQuick-TM 试剂盒（美国SBI 公司）说明书进行操作，取100 μL 加入150 μL 磷酸缓冲盐（PBS）溶液（上海博湖生物科技有限公司，货号：BH-6605）稀释，然后加入63 μL ExoQuick 试剂混匀，离心分离出外泌体，最后使用透射电子显微镜（北京欧波同光学技术有限公司，型号：Talos F200X S/TEM）鉴定所提取的外泌体的形态、大小以及微结构。②RNA 提取、逆转录及荧光定量PCR 法：采用美国Thermo 公司生产的Trizol 试剂提取总RNA，使用One Step Prime Script miRNA c DNA 合成试剂盒行逆转录反应，将RNA 反转录成cDNA，并使用实时荧光定量PCR 法检测精浆外泌体中的miR-184 水平，应用相对定量法来计算miR-184 的相对表达量，公式：2-ΔCt值=2-ΔCt值（miR-184）-2-ΔCt（miR-39），miR-39 为外参基因。（4）通过Spearman 秩相关分析男性不育患者精液质量与微量元素水平及外泌体中miR-184 水平的相关性。r值：0.1 ≤ 低度相关 ≤ 0.3，0.3 ＜ 中度相关≤ 0.7，0.7 ＜ 高度相关。

1.5 统计学方法选用SPSS 19.0 统计学软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，计数资料以构成比或率（%）表示，组间比较行χ2检验；相关性采用Spearman 秩相关分析检验；以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组精液质量参数比较不育组精子浓度、精子总活力（PR+NP）、前向运动精子（PR）、精子平均曲线运动速度、精子平均直线运动速度、精子平均路径运动速度、精子头部侧向平均振幅（ALH）显著低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组精液质量参数比较Tab.2 Comparison of semen quality parameters between two groups ±s

表2 两组精液质量参数比较Tab.2 Comparison of semen quality parameters between two groups ±s

精液参数精子浓度（106/mL）PR+NP（%）PR（%）精子平均曲线运动速度（μm/s）精子平均直线运动速度（μm/s）精子平均路径运动速度（μm/s）ALH（μm）不育组（n = 155）36.05±6.25 42.56±7.11 35.25±5.23 31.15±4.12 13.19±2.12 15.85±2.12 1.62±0.16正常组（n = 155）45.98±9.56 51.15±6.56 42.65±7.15 40.22±5.85 19.15±3.12 23.45±5.12 2.38±0.21 t值10.824 11.055 10.400 15.782 19.671 17.075 35.840 P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 两组精浆微量元素水平及精浆外泌体中miR-184 相对表达量比较两组Fe 水平比较差异无统计学意义（P> 0.05），不育组Zn、Mg、Ca 水平显著低于正常组，Cu、Pb 水平及miR-184 相对表达量高于正常组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表3。

表3 两组精浆微量元素水平及精浆外泌体中miR-184 相对表达量比较Tab.3 Comparison of trace element levels and relative expression levels of miR-184 in seminal plasma exosomes between two groups ±s

表3 两组精浆微量元素水平及精浆外泌体中miR-184 相对表达量比较Tab.3 Comparison of trace element levels and relative expression levels of miR-184 in seminal plasma exosomes between two groups ±s

组别不育组（n = 155）正常组（n = 155）t值P值Zn（μmol/L）8.19±2.65 14.26±2.35 21.336 0.000 Cu（μmol/L）41.85±4.05 21.56±2.16 55.035 0.000 Mg（mmol/L）0.87±0.02 0.93±0.11 6.681 0.000 Ca（mmol/L）1.98±0.23 2.36±0.14 17.570 0.000 Fe（mmol/L）8.36±1.12 8.29±1.22 0.526 0.599 Pb（μg/mL）10.95±2.11 5.46±1.05 29.001 0.000 miR-184 1.25±0.19 0.72±0.15 27.258 0.000

2.3 男性不育患者精液质量与精浆微量元素水平的相关性男性不育患者Zn、Cu 元素水平分别与精子浓度、PR+NP、PR 呈正、负相关（P＜ 0.05），Pb 元素水平与ALH 呈负相关（P＜ 0.05），见表4。

表4 男性不育患者精液质量与精浆微量元素水平的相关性Tab.4 Correlation between semen quality and trace element levels in semen of male infertility patients r 值

2.4 男性不育患者精液质量与外泌体中miR-184相对表达量的相关性男性不育患者miR-184 相对表达量与精子浓度、PR+NP、PR、精子平均曲线运动速度呈负相关（P＜ 0.05），见表5。

表5 男性不育患者精液质量与外泌体中miR-184 相对表达量的相关性Tab.5 Correlation between semen quality and relative expression of miR-184 in exosomes of male infertility patientsr 值

3 讨论

Zn、Mg、Ca 等各种微量元素以游离或结合形式存在于男性精浆中，可作为营养介质促进其精子成熟，与男性生殖系统发育、性功能以及性激素水平密切相关，其中某些元素代谢异常可引发男性不育症［8］。既往研究证实［9］，外泌体主要由各种不同的细胞分泌，稳定存在于人体体液中，可直接反映其细胞生理、病理改变。同时外泌体可携带miRNA 等特定功能性分子无障碍进入其受体细胞，进而调控受体细胞的基因表达。国内外研究报道［10］，男性精浆中含有外泌体，其所含微囊泡可保护mRNA，且miRNA 与男性不育联系密切，因而检测外泌体中miRNA 对男性不育分子标志物研发具有积极意义，但关于精浆外泌体中miR-184在男性不育患者表达变化特征以及价值报道颇少。因此本研究观察男性不育患者精液质量与精浆微量元素水平及精浆外泌体中miR-184 水平的关系。

本研究结果显示，不育组精子浓度、PR+NP、PR、精子平均曲线运动速度、精子平均直线运动速度、精子平均路径运动速度、ALH 显著低于正常组，提示男性不育发生后，其精子质量随之降低，且精浆外泌体中miR-184 水平和男性不育发生联系密切。有研究［11］指出，男性不育可能与生殖系统的结构或功能异常有关，如阻塞性精索静脉曲张、输精管堵塞、附睾炎等问题会导致男性不育患者精子无法正常到达射精液中。同时，睾丸作为男性精子产生地，睾丸损伤、睾丸发育异常、睾丸炎症等异常会导致精子数量减少或质量下降。而睾酮作为主要的男性激素，其分泌异常可影响其精子质量［12］。此外，吸烟、饮酒过量、药物滥用、暴露于有害化学物质或辐射等不良生活方式、环境因素以及染色体异常、单基因疾病等遗传疾病也可能导致男性不育和精子质量下降［13］。又有研究指出［14-16］，miR-184 表达于男性睾丸、脑组织以及上皮组织，且睾丸中miR-184 表达水平远远高于脑组织，是睾丸特异性高表达的miRNA。此外，男性一般出生后，其睾丸组织中miR-184 表达随着睾丸的发育持续升高，且miR-184 表达显著聚集于与精子发生联系密切的睾丸生精细胞中。因而推测精浆外泌体中miR-184 可能来源于睾丸组织中的生精细胞，男性不育患者由于精子功能发生改变以及生精细胞凋亡增加，进而导致精浆外泌体miR-184 的水平显著高于正常男性，与本研究结果相互印证。

本研究结果显示，不育组Zn、Mg、Ca 水平显著低于正常组，Cu、Pb 水平及miR-184 相对表达量高于正常组，男性不育患者Zn 元素水平与精子浓度、PR+NP、PR呈正相关，Cu元素水平与精子浓度、PR+NP、PR呈负相关，Pb元素水平与ALH呈负相关，与BARBU 等［17］研究结论相符。BEIGIHARCHEGANI等［18］研究指出，Zn 不仅是人体不可或缺的微量元素之一，还是男性精液中最关键的微量元素之一，在其男性生殖系统含量较高，能有效缓解男性精子膜脂质氧化，保持胞膜结构完整性、稳定性。同时，Zn 元素存在于男性睾丸内的睾细胞中，参与精子生成、获能、成熟过程以及脑垂体促性腺激素的调节，因此当男性不育患者精浆中Zn 元素缺乏时，会对其精子发生、成熟、获能过程以及性腺内分泌功能、生殖功能造成负面影响，并导致精子功能、性腺内分泌功能及生殖功能障碍，影响其活性，降低精子质量与活性，最终造成不育［19-21］。本研究发现，男性不育患者精浆中Cu 元素水平明显升高，且与其精子密度、PR+NP、PR 呈负相关，原因可能是Cu 作为许多酶的特有活性成分，水平增高不仅直接减弱男性不育患者精子活力，还会通过干扰垂体分泌功能，影响其精子活力，导致精子质量下降［22-23］。此外本研究中男性不育患者Pb 水平较高，Pb 元素水平与精子头部侧向平均振幅呈负相关，主要是由于Pb 对男性不育患者生殖系统具有毒性作用，含量过多会过度消耗其体内抗氧化物酶活性，进而导致男性生殖功能出现障碍，即使Pb 浓度较低亦会对其精子头部侧向平均振幅造成影响［24-25］。

本研究结果显示，男性不育患者miR-184 相对表达量与精子浓度、PR+NP、PR、精子平均曲线运动速度呈负相关，提示随着男性不育患者miR-184相对表达量的显著升高，其精子浓度、PR+NP、PR会降低，精子平均曲线运动速度会减弱。有研究［26］表示，高表达miR-184 可干扰男性不育患者精子正常发育和成熟过程，致使精子产生或释放异常，导致其精子数量减少、密度降低。同时，miR-184的高表达可能与炎症反应和损伤修复密切相关，如男性不育患者存在炎症反应或损伤，可导致miR-184表达增加，进而影响到精子数量和密度［27］。而又有研究［28］表示，miR-184 作为一种微小RNA，在男性不育患者细胞内起着负向调控基因表达的作用，当精浆外泌体中miR-184 的表达量增加时，其可通过抑制特定基因表达，影响精子活动力相关基因表达，从而降低精子活动率。同时，高表达的miR-184 可干扰男性不育患者精子形态和结构的正常发育，致使其精子运动能力较弱，无法有效地前进或到达目标地点，怀疑可能与精子形态异常、精子运动能力减弱、精子鞭毛缺陷等问题密切相关［29］。本研究中男性不育患者miR-184 相对表达量与精子平均曲线运动速度呈负相关，主要是由于高表达的miR-184 通过靶向调控男性不育患者精子运动能力相关基因，干扰精子能量代谢通路和细胞结构的正常发育，促使其发生精子鞭毛缺陷、线粒体功能异常等问题，并导致精子存活能力下降，游动时间缩短，进而致使精子平均曲线运动速度降低［30-31］。基于以上分析，证实微量元素水平及外泌体中miR-184 水平可能为男性不育治疗提供参考，故今后治疗男性不育可尝试性指导患者摄入微量元素相关药物及针对miR-184指标的相应药物用于改善其精液质量。这些措施可能会对男性不育患者的治疗产生积极影响，但具体效果还需要进一步的研究和临床实践来验证。

综上所述，男性不育患者精液质量与微量元素水平及外泌体中miR-184 水平密切相关，微量元素水平及外泌体中miR-184 水平可能为男性不育治疗提供指导。此外，本研究仍存在一定局限性，如男性不育患者精液质量可能受年龄等较多因素影响，本文更多的是观察微量元素与miR-184指标，后续研究可纳入更多相关临床指标。

【Author contributions】CHEN Fu performed the experiments and wrote the article.LIU Bin performed the experiments.HE Shuaijun and ZHAO Yong revised the article.WANG Weizhou designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.