补体C3水平对冻融胚胎移植妊娠结局的早期预测价值

唐志霞 马双影 张影 盛佳佳 李娟 何晶晶 宣恒华 洪名云

安徽省妇幼保健院/安徽医科大学附属妇幼保健院生殖中心（合肥 230001）

随着玻璃化冷冻技术的不断成熟，冻融胚胎移植（frozen thawned-embryo transfer， F-ET）周期数越来越多，其可以明显降低卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome， OHSS）发生和增加每个取卵周期累计妊娠率。改善胚胎质量和子宫内膜容受性的方法不断被优化，仍然有不少患者会出现反复种植失败（recurrent implantation failure， RIF）的情况，RIF 的发生率5%～10%［1］。在正常妊娠的过程中，作为半同种异体的胚胎不会出现被母体免疫系统排斥的现象，而是一直维持到妊娠分娩，称之为母胎免疫耐受［2］。而补体对于适应性免疫具有免疫调节作用，其最初存在于体内是无活性的前体物质，一旦被激活后，就会产生一连串生物学效应，进而达到维持组织稳态、免疫监督和细胞完整性等作用［3］。

关于免疫因素在调控胚胎着床和妊娠维持的研究越来越多。适当激活的补体成分对维持正常的妊娠是必需的，就拿胚胎滋养层来说，一定水平的补体有利于免疫防御病原体、新血管生成和滋养细胞迁移［4-5］。与正常妊娠患者相比，复发性流产（recurrent spontaneous abortion， RSA）患者血清补体C3 水平明显升高［6-7］，补体水平升高可预警RSA 患者即将流产［6］。补体异常激活或者水平太低可能都对妊娠结局产生不利影响，适当的补体水平才是成功妊娠的必备要素。补体C3 在RSA患者［6-7］、早孕和晚孕期［8］、系统性红斑狼疮［9］、抗心磷脂综合征［10］和干燥综合征［11］等自身免疫性疾病患者均有相关研究，然而补体C3 水平对F-ET 周期妊娠结局有无预测价值，暂无相关研究。本研究初步探讨补体C3 水平对F-ET 妊娠结局的早期预测价值，希望以后能提早干预，进而改善F-ET妊娠结局。

1 资料与方法

1.1 研究对象前瞻性收集2022年6月至2023年3 月在安徽医科大学附属妇幼保健院生殖中心行F-ET 的不孕症患者，纳入标准：年龄≤ 43 岁、有冷冻胚胎、拟行F-ET 患者；依从性好并知情同意并签字。排除标准：抗磷脂综合征、系统性红斑狼疮、干燥综合征、桥本氏甲状腺炎、类风湿性关节炎、各种原发性或继发性肾脏疾病、过敏性紫癜、未分化结缔组织疾病等自身免疫性疾病、子宫内膜异位症、子宫肌瘤及腺肌瘤以及子宫畸形等；内分泌异常；双方染色体异常；感染和夫妻血型不合等因素，最终纳入378 个周期。本研究通过生殖医学伦理委员会审核（批件号：20220513）并获得患者知情同意。

1.2 分组收集患者基础资料以及移植日补体C3、C4 水平，根据妊娠结局分为两组，选用回归分析探讨影响F-ET 临床结局的可能因素，受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC 曲线）计算补体C3 水平预测F-ET 妊娠结局的最佳截断值，随后根据ROC 曲线C3 截断值进行分组，分为两组：A组（补体C3 ≤ 1.05）：120个周期，B 组（补体C3 > 1.05）：258 个周期，比较两组妊娠结局，最后ROC 曲线进一步计算B 组补体C3 对F-ET 后预测自然流产的最佳截断值。

1.3 补体C3 和C4 的检测方法移植日收集所有患者外周静脉血5 mL， 在 4 ℃、3 500 r/min 的条件下离心处理10 min，血清置于-80 ℃的冰箱中保存。采用免疫透射比浊法检测血清补体C3、C4 水平，具体检测步骤按照说明书操作。

1.4 F-ET 周期采用激素替代周期和自然周期方案调节子宫内膜，遵循本中心常规黄体支持方案和F-ET 的操作规范。

1.5 妊娠结局随访F-ET 术后30 d 阴道超声检查可见宫内妊娠囊或异位妊娠者为临床妊娠；妊娠28 周之前自然终止妊娠者为自然流产。临床妊娠率计算方法：临床妊娠周期数除以移植周期数×100%；胚胎着床率计算方法：宫内妊娠孕囊数除以移植胚胎数×100%；流产率计算方法：妊娠28 周之前流产周期数除以临床妊娠周期数×100%。

1.6 统计学方法所有数据采用SPSS 26.0 软件进行统计分析。对符合正态分布的定量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本的t检验［12］；对不符合正态分布的计量资料采用M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验［12］；定性资料采用以%表示，组间比较采用χ2检验或Fisher 检验［12］。logistic 回归单因素分析具有统计学意义（P＜ 0.05）的因素再次纳入二元logistic回归多因素分析，从而得到F-ET 临床妊娠结局独立的风险因素［12］。对分类变量进行以下赋值，不孕类型（原发不孕=0，继发不孕=1）；周期类型（自然周期=0，激素替代=1）；胚胎类型（卵裂期=0，囊胚期=1）；受精类型（IVF=0， ICSI=1）。绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve， ROC 曲线）并计算曲线下面积（area under the curve， AUC）［12］；以约登（Youden）指数最大值时作为最佳截断值（cut-off）［12］。均以P＜ 0.05 为差异有统计学意义［12］。

2 结果

本研究共纳入F-ET 周期数378 个周期，其中临床妊娠周期数201 个周期，临床妊娠率53.17%，自然流产周期数33 个周期，自然流产率16.42%。

2.1 影响F-ET 临床结局相关因素的logistic 回归分析以临床妊娠结局为因变量，分别将年龄、不孕类型（原发不孕=0，继发不孕=1）、不孕年限、体质量指数、补体C3 水平、补体C4 水平、促甲状腺激素、CA125、空腹血糖、周期类型（自然周期=0，激素替代=1）、内膜厚度、移植胚胎数、胚胎类型（卵裂期=0，囊胚期=1）以及受精类型（IVF=0，ICSI=1）纳入自变量分析，结果显示：年龄、不孕年限、补体C3 水平和胚胎类型是F-ET 临床妊娠结局相关预测因子（P＜ 0.05），见表1。logistic 单因素回归分析结果具有统计学意义（P＜ 0.05）的因素再次纳入二元logistic 回归多因素分析，以临床妊娠结局为因变量，年龄、不孕年限、补体C3 水平和胚胎类型纳入自变量进行分析，结果显示：年龄是F-ET临床妊娠成功的危险因素（OR= 0.946，95%CI：0.898～0.996，P= 0.035）；补体C3 是F-ET 临床妊娠成功的保护因素（OR= 83.812，95%CI：21.782～322.495，P＜ 0.001）；囊胚移植较卵裂期胚胎移植有较好的临床妊娠结局（OR= 2.210， 95%CI：1.391～3.511，P= 0.001），这三者对F-ET 临床妊娠结局的影响差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2。

表1 影响F-ET 临床妊娠结局相关因素的Logistic 单因素回归分析Tab.1 Logistic single factor regression analysis of factors affecting the clinical pregnancy outcome of F-ET

表2 影响FET 临床妊娠结局相关因素的logistic 多因素回归分析Tab.2 Logistic multiple factor regression analysis of factors affecting the clinical pregnancy outcome of F-ET

2.2 补体C3 对F-ET 临床妊娠结局的早期预测价值ROC 曲线结果显示：补体C3 水平的AUC 为0.702，最佳截断值为1.05 g/L，约登指数0.396，敏感度87.60%，特异度52.00%，见图1。

图1 补体C3 对F-ET 临床妊娠结局早期预测价值的ROC曲线Fig.1 ROC curve for early prediction of clinical pregnancy outcome of F-ET using complement C3

2.3 补体C3 对F-ET 妊娠结局的影响根据ROC曲线补体C3 水平截断值进行分组，分为两组：A组（补体C3 ≤ 1.05）：120 个周期；B 组（补体C3 >1.05）：258 个周期。两组患者的一般资料如年龄、体质量指数、补体C4 水平、促甲状腺激素、空腹血糖、CA125、不孕年限、不孕类型、子宫内膜厚度、移植胚胎数、周期类型、受精类型以及胚胎类型相比，均差异无统计学意义（P> 0.05）。见表3。B 组的临床妊娠率（67.05%）明显高于A 组（23.33%），且差异有统计学意义（P＜ 0.05）。B 组的着床率（52.75%）明显高于A 组（20.73%），差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表4。

表3 不同补体C3 水平组间患者的基本资料Tab.3 Basic data of patients with different levels of complement C3 ±s

表3 不同补体C3 水平组间患者的基本资料Tab.3 Basic data of patients with different levels of complement C3 ±s

组别周期数（个）年龄（岁）体质量指数（kg/m2）补体C4（g/L）促甲状腺激素（μIU/mL）空腹血糖（mmol/l）CA125［M（P25，P75），ng/mL］不孕年限［M（P25，P75），年］不孕类型［例（%）］原发性不孕继发性不孕子宫内膜厚度（mm）移植胚胎数（个）周期类型［例（%）］自然周期替代周期受精类型［例（%）］IVF ICSI胚胎类型［例（%）］卵裂期囊胚期A组120 33.14±4.49 22.25±3.18 0.26±0.09 2.20±0.99 5.18±0.42 9.85（6.55，15.23）2.5（1.00，4.75）B组258 32.16±4.54 22.90±2.97 0.27±0.10 2.26±1.06 5.23±0.43 11.90（7.68，16.33）2.00（1.75，4.00）t/Z/χ2值P值1.959-1.932-0.267-0.500-1.070-1.765-0.062 0.116 0.051 0.054 0.790 0.617 0.285 0.078 0.950 0.733 52（43.33）68（56.67）10.52±2.14 1.37±0.48 107（41.47）151（58.53）10.61±2.10 1.41±0.49-0.385-0.816 0.135 0.700 0.415 0.713 17（14.17）103（85.83）33（12.79）225（87.21）0.313 0.576 88（73.33）32（26.67）182（70.54）76（29.46）0.417 0.519 54（45.00）66（55.00）107（41.47）151（58.53）

表4 不同补体C3 水平组间患者妊娠结局情况Tab.4 Pregnancy outcomes of patients with different levels of complement C3 例（%）

2.4 补体C3对自然流产的早期预测价值ROC曲线结果显示：补体C3 水平的AUC 为0.760，最佳截断值为1.32 g/L， 约登指数0.502，敏感度69.00%，特异度81.20%，见图2。

3 讨论

胚胎成功着床是F-ET 良好妊娠结局的开端，而补体系统在调控机体的免疫系统、防御功能、胚胎着床和妊娠维持中均起着极其关键的作用。本研究选取logistic 回归分析和ROC 曲线探讨补体C3 对F-ET 妊娠结局的早期预测价值。研究发现年龄是F-ET 临床妊娠成功的独立危险因素，补体C3 水平和胚胎类型是F-ET 临床妊娠成功的保护因素，补体C3 水平对早期预测F-ET 妊娠结局有一定的临床意义，其中补体C3 水平超过1.32 g/L 可能会导致自然流产率升高。

众所周知，胚胎质量是影响胚胎着床的重要因素之一，而高龄女性患者可能会有冷冻胚胎，但存在胚胎质量差；胚胎发育潜能欠佳；线粒体数量减少；非整倍体率升高；流产率升高和临床妊娠率降低的风险。年龄是影响F-ET 妊娠结局的重要因素之一［13-14］。本研究多因素logistic 回归分析也发现年龄是F-ET 临床妊娠成功的危险因素（OR=0.946，95%CI：0.898～0.996，P= 0.035）。同时本研究logistic 单因素回归分析发现：不孕年限可能是影响F-ET 妊娠结局的因素（P＜ 0.05）；但logistic多因素回归分析发现：其并不是影响F-ET 妊娠结局的独立危险因素（P> 0.05）。因此，本研究认为不孕年限不能单独用来预测F-ET 妊娠结局。

由于囊胚期胚胎是在体外继续培养最终筛选形成的发育潜能更高的胚胎，因此，行囊胚期胚胎ET 可以改善妊娠结局，提高临床妊娠率和胚胎着床率［15-18］。本研究也发现囊胚移植较卵裂期胚胎移植有较好的临床妊娠结局（OR= 2.210，95%CI：1.391～3.511，P= 0.001），与陈曼等［19］的研究结论一致。基于这样的结果，持续优化本中心的移植策略，优先选择ET 囊胚期胚胎提高临床妊娠率，让更多的患者尽快达到生育的目的。

具有一定酶活性的补体系统广泛分布在妊娠母胎界面、血液以及各种组织中。在维持妊娠的过程中，功能正常的补体系统发挥着举足轻重的作用［20-22］。本研究发现补体C3 水平是F-ET 临床妊娠的保护因素（OR= 83.812，95%CI：21.782～322.495，P＜ 0.001），其对F-ET 患者妊娠结局的AUC 为0.702， cut-off 值为1.05 g/L，此时其预测不孕症患者接受F-ET 后获得临床妊娠的灵敏度为87.60%、特异度为52.00%。说明补体C3 水平对早期预测F-ET 妊娠结局有一定的临床意义。同时本研究还发现：当排除年龄、不孕年限和胚胎类型等影响F-ET 妊娠结局的干扰因素之后，移植日补体C3 水平> 1.05 g/L 后F-ET 临床妊娠率和着床率明显高于移植日补体C3 ≤ 1.05 g/L（P＜ 0.05）。这一点也再次验证了既往的研究，一定程度的补体C3 水平激活有利于胚胎着床。

补体C3 在人体内的含量是第一位，补体C4次之，在补体系统激活过程中补体C3 起着非常关键的作用。在生理条件下，一旦补体被激活，首先裂解出许多可以趋化炎症细胞和增强白细胞吞噬功能的补体片段，提高机体防御能力，从而维持正常妊娠，但是如果母胎界面上补体过度激活会导致胎儿死亡。异常激活的补体会产生一连串的免疫性损伤，从而影响胚胎着床以及导致妊娠丢失。与正常孕妇相比，稽留流产患者体内补体水平明显升高，补体C3 升高使得炎症细胞大量汇集到胚胎组织，从而发生稽留流产［23］。有研究［24］认为补体C3 升高与静脉血栓形成相关，而静脉血栓的形成又会影响母胎界面的血流灌注，与RSA 和RIF密切相关。基于这样的研究基础，我们推测补体C3 水平对F-ET 后自然流产具有一定的早期预测价值。本研究ROC 曲线结果显示：补体C3 水平预测自然流产的AUC为0.760，最佳截断值为1.32 g/L，约登指数0.502，敏感度69.00%，特异度81.20%。F-ET 后胚胎成功着床以及妊娠的维持均需要一定水平的补体C3 水平，当补体C3 水平过高可能会增加自然流产的风险，从而也证实我们的推测。

综上所述，补体激活程度在机体可控范围内，一定程度的补体水平将有利于F-ET 后胚胎着床；如果体内补体过度激活，可能会导致妊娠失败。本研究采用logistic 回归分析探讨影响F-ET 临床妊娠结局相关因素，通过ROC 曲线得出了补体C3水平预测临床妊娠结局以及自然流产的最佳截断值，对临床应用有一定的指导价值。在不远的将来，在F-ET 周期调控补体C3 的水平有望为改善患者妊娠结局提供治疗思路。然而，本研究未分析活产率，存在一定的局限性，后期将以活产率作为因变量进一步证实，同时希望进一步设计预处理方案的对照研究进一步证实。

【Author contributions】TANG Zhixia performed the experiments and wrote the article.MA Shuangying， ZHAGN Ying and SHEGN Jiajia analyzed the data.LI Juan， HE Jingjing and XUAN Henghua collected samples and prepared tables.HONG Mingyun reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.