经后增殖方对控制性超促排卵大鼠卵巢GDF9分泌及颗粒细胞凋亡的影响

杨贞 江少如 陈小燕 陈晓琳 邓伟民 郭新宇

1揭阳市人民医院（广东揭阳 522000）；2中国人民解放军南部战区总医院（广州 510010）；3前海人寿广州总医院（广州 511325）

作为体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer， IVF-ET）的重要环节，控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation， COH）的应用促使多个卵泡同时发育。已有研究证实COH 的过程中，促性腺激素释放激素激动剂、促性腺激素的使用，可能破坏卵细胞遗传物质的稳定性和核质成熟的同步性，影响卵细胞发育，降低胚胎质量、着床率和妊娠率［1-2］。因此，如何提高卵泡及胚胎质量一直是生殖医学领域的重点关注问题和研究热点。

本课题组前期的临床研究证实，具有益气血作用的经后增殖方能提高IVF-ET 中胚胎移植成功率和妊娠率［3］，随后的动物实验研究证实经后增殖方能降低COH 大鼠卵巢组织中促凋亡蛋白Bim 的表达，提高生长分化因子9（growth differentiation factor 9， GDF9）基因和蛋白的表达，促进卵泡发育［4］。但经后增殖方通过哪些与细胞增殖和凋亡有关的通路实现上述作用尚不清楚。本研究拟通过对p38MAPK 和NF-κB 信号通路相关因子表达的检测，观察经后增殖方对COH 大鼠卵巢GDF9 分泌及颗粒细胞（granulosa cells，GCs）凋亡的影响，探讨其作用机制，完善益气血法经后增殖方应用于IVF-ET 的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级SD雌性大鼠18只，鼠龄6～8周，体质量180～220 g，由南方医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2021-0041，饲养于SPF 实验室，光照12 h 昼夜交替，自由取水和摄食，适应性饲养1 周后开始实验，以阴道脱落细胞涂片检查动情周期。动物实验方案已获得医院伦理委员会批准，批准编号：201903。实验遵照《关于善待实验动物的指导性意见》（国科发财字〔2006〕398 号）。

1.2 药品醋酸曲普瑞林（GnRHa，瑞士辉凌，批号：S11775A），孕马血清促性腺激素（PMSG，北京索莱宝，批号：601Q021），人绒毛膜促性腺激素（HCG，丽珠药业，批号：201202），经后增殖方（颗粒剂，10 g/袋，相当于生药：党参15 g、白术12 g、茯苓12 g、甘草6 g、熟地黄12 g、白芍12 g、当归6 g、川芎6 g、菟丝子15 g、鹿角霜20 g、杜仲15 g、山萸肉10 g、川椒3 g。广东一方制药，批号：J2001003）。

1.3 主要试剂及仪器逆转录试剂盒（美国Thermo，货号：K1622），荧光定量PCR 检测试剂盒（美国Genecopoeia，货号：AOPR-1200），BCA法蛋白含量检测试剂盒（南京凯基生物，货号：KGPBCA），HRP标记的GAPDH优质内参（上海康成生物，货号：KC-5G5），Anti-GDF9抗体（英国abcam，货号：ab93892），Anti-p38（phospho T180+Y182）抗体（英国abcam，货号：ab4822），Anti-NF-κB p65 抗体（英国abcam，货号：ab140751），Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），Mouse/Human ads-HRP（美国Southern Biotech，货号：4050-05），Tunel试剂盒（美国Promega，货号：G3250）。

荧光定量PCR 仪（美国ABI，型号：7500），酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific，型号：multiscan MK3），垂直电泳槽（上海天能，型号：VE180），转移电泳槽（上海天能，型号：VE186），电泳仪（北京百晶生物，型号：BG-Power 600i），倒置荧光显微镜（德国Leica，型号：DMI6000B）。

1.4 造模及干预方法18 只雌性SD 大鼠随机分为3 组：自然排卵（natural ovulation， NO）组（NO组）、COH 组、COH+经后增殖方（Jinghou Zengzhi Granules， JHZZG）组（COH + JHZZG 组）。阴道涂片为动情周期第3 天时，COH + JHZZG 组大鼠每天上午9 时给予JHZZG 4.5 g/kg 灌胃，给药浓度0.33 g/mL，连续9 d；同时于每天上午9 时腹腔注射GnRHa 2.0 μg/100 g，给药浓度为20 μg/mL，连续7 d，第7天同时注射PMSG 40 IU/100 g，给药浓度为400 IU/mL，48 h 后注射HCG 100 IU/100 g，给药浓度为1 000 IU/mL，2 h后处死；COH组等体积生理盐水灌胃，腹腔注射同COH + JHZZG 组。NO 组等体积生理盐水灌胃及腹腔注射，阴道涂片，进入动情期后处死。3组大鼠处死方式均为腹腔注射10%水合氯醛，剂量为4.0 mL/kg，深入麻醉大鼠后腹主动脉取血留用（用于后续实验）；取血后大鼠死亡，快速取出大鼠双侧卵巢，一侧卵巢经液氮速冻后于-80 ℃冻存，用于mRNA和蛋白表达的检测；另一侧卵巢置于4%多聚甲醛中固定，用于TUNEL 检测。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 qRT-PCR方法检测卵巢中p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA的表达qPCR操作按试剂盒说明书进行。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，PCR 反应条件为：95 ℃、10 min 预变性；95 ℃、10 s，55 ℃、20 s，72 ℃、35 s，退火、变性、延伸，40 个循环。循环结束后从55 ℃升高到95 ℃获取熔解曲线。以β-actin 进行参照，以2-ΔΔCt值表示p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA 的相对表达量。各基因名称、引物序列及扩增长度见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.5.2 Western blot 方法检测卵巢中p38MAPK、NF-κB、GDF9 蛋白的表达提取大鼠卵巢组织总蛋白，用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白水平后，SDS-PAGE 电泳，蛋白质PVDF 膜上转膜，添加一抗Anti-GDF9 抗体（1∶5 000 稀释），Anti-p38（phospho T180+Y182）抗体（1∶5 000 稀释），Anti-NF-κB p65抗体（1∶5 000稀释）及二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H + L），Mouse/Human ads-HRP（1∶20 000 稀释），添加发光液，显影，Image J 软件处理系统分析蛋白及内参灰度值。

1.5.3 TUNEL法检测卵巢GCs凋亡率TUNEL检测操作按试剂盒说明书进行，荧光镜下观察，200倍视野拍照，用Image J软件处理系统分析GCs凋亡率。

1.6 统计学方法采用SPSS 26.0 软件进行统计学分析。数据用±s表示，多组间比较用单因素方差分析，方差齐性检验采用Levene 法，当方差不齐时，采用Welch 检验（校正F检验）。qRT-PCR 结果方差不齐，组间的多重比较选择Tamhane's T2检验分析；Western blot、TUNEL 结果方差齐，组间的多重比较选择Bonferroni 检验分析。以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠卵巢组织中p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA 表达比较与NO 组比较，COH组大鼠卵巢组织中p38MAPK、NF-κB的表达升高（P＜ 0.01），CK2、IκBα 的表达下降（P＜ 0.01），GDF9的表达减少（P＜ 0.01）；与COH组比较，COH +JHZZG组大鼠卵巢组织中p38MAPK、NF-κB的表达下降（P＜ 0.01），CK2、IκBα 的表达升高（P＜ 0.01），GDF9的表达增加（P＜ 0.01）。见表2。

表2 各组大鼠卵巢组织中p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA 表达比较Tab.2 Expression of p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA in ovarian tissues ±s

表2 各组大鼠卵巢组织中p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA 表达比较Tab.2 Expression of p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA in ovarian tissues ±s

注：与NO组比较，*P ＜ 0.01，与COH组比较，△P ＜ 0.01

组别NO组COH组COH+JHZZG组校正F值P值GDF9 1.113±0.134 0.300±0.089*0.573±0.026*△70.690＜ 0.001例数666 p38MAPK 1.157±0.206 4.355±0.626*2.760±0.644*△75.236＜ 0.001 CK2 1.248±0.260 0.290±0.073*0.575±0.086*△45.576＜ 0.001 IκBα 1.155±0.203 0.605±0.094*2.488±0.571*△43.222＜ 0.001 NF-κB 0.968±0.097 3.458±0.383*2.393±0.323*△148.933＜ 0.001

2.2 各组大鼠卵巢组织中p38MAPK、NF-κB、GDF9 蛋白表达比较与NO 组比较，COH 组大鼠卵巢组织中p38MAPK、NF-κB 的表达升高（P＜0.01），GDF9 的表达下降（P＜ 0.01）；与COH 组比较，COH+JHZZG 组大鼠卵巢组织中p38MAPK、NF-κB 的表达下降（P＜ 0.01），GDF9 的表达升高（P＜ 0.01）。见图1。

注：A：NO 组，B：COH 组，C：COH + JHZZG 组；与NO 组比较，*P ＜ 0.01；与COH 组比较，△P ＜ 0.01图1 各组大鼠卵巢组织中p38MAPK、NF-κB、GDF9 蛋白表达比较Fig.1 Expression of p38MAPK， NF-κB， GDF9 proteins in ovarian tissues

2.3 各组大鼠卵巢GCs 凋亡率比较TUNEL 染色后，荧光镜下，以细胞核呈棕黄色为阳性凋亡细胞。自然排卵组呈现棕黄色的细胞核少，COH 组呈现棕黄色的细胞核多，中药干预后呈现棕黄色的细胞核减少；与NO 组比较，COH 组大鼠卵巢GCs 凋亡率升高（P＜ 0.01）；与COH 组比较，COH+JHZZG 组大鼠卵巢GCs 凋亡率下降（P＜ 0.01）。见图2、表3。

图2 各组卵巢GCs 凋亡率比较（苏木素染色，× 200）Fig.2 Ovarian granulosa cells （hematoxylin staining， × 200）

表3 各组大鼠卵巢GCs 凋亡率比较Tab.3 Apoptosis rate of ovarian granulosa cells ±s

表3 各组大鼠卵巢GCs 凋亡率比较Tab.3 Apoptosis rate of ovarian granulosa cells ±s

注：与NO组比较，*P ＜ 0.01，与COH组比较，△P ＜ 0.01

组别NO组COH组COH+JHZZG组F值P值凋亡率0.255±0.032 0.368±0.033*0.266±0.070△10.107 0.002例数666

3 讨论

卵泡中存在大量的GCs，通过合成和表达多种激素、生长因子及其受体，调节卵母细胞和卵泡的发育［5-6］。GCs 的凋亡可抑制该过程，促进卵泡闭锁［1，7-8］。GDF9 能调节GCs 对促卵泡生成素的敏感性［9-10］，调控GCs 的增殖、分化和排卵及卵泡黄素化［11-12］，是卵泡发育的重要因子。IVF-ET不可避免地需使用COH 以获取足够数量的卵泡。本研究结果显示，与自然排卵组比较，COH 降低了卵巢组织GDF9 的表达，使GCs 凋亡率显著升高。与以往的研究结果相符，提示COH 降低了卵泡质量。

目前关于GDF9 与SMAD 信号通路之间关系的研究已较成熟，有研究发现猪的卵细胞分泌的GDF9 可以通过PI3K/FOXO3a 通路介导，使卵丘细胞凋亡调节蛋白BimEL 表达处于低水平［13］。而GDF9 的调节机制很复杂，仍未完全清楚，目前研究热点在其调节机制上及与其他信号通路是否存在联系，而关于GDF9 与p38MAPK 和NF-κB 通路及与卵巢GCs 凋亡关系的研究均鲜有报道。

p38MAPK 是丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinases， MAPKs）家族的成员，由细胞外的多种应激反应信号与受体特异性结合而激活，控制多种转录因子的基因表达活性，在细胞因子产生、基因转录、翻译和细胞凋亡过程中起重要作用［14］。在睾丸、卵巢中主要有p38δ 亚型的表达［15］。NF-κB 作为细胞核内重要的转录调节因子，属于NF-κB/Rel 蛋白家族，参与机体炎症、组织损伤修复及免疫等调节［16］，在卵细胞生长和胚胎发育等过程中调控与凋亡有关的基因表达［17］。此前有研究在DNA 损伤的细胞中发现p38MAPK 能激活酪蛋白激酶2（casein kinase 2， CK2），介导NF-κB 抑制因子α（inhibitor of NF-κB-α， IκBα）磷酸化，继而激活NF-κB［18］。活化的NF-κB 通过线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径调节细胞凋亡的过程［19-21］。本研究中，与自然排卵组比较，COH 促使p38MAPK 和NF-κB 表达增加，CK2 和IκBα 表达减少，这可能是COH 使GDP9 分泌减少，GCs 凋亡增加的作用途径。

现代医学“下丘脑-垂体-卵巢”性腺轴与中医学“肾气-天癸-冲任”生殖轴相对相应。不孕症与肾气亏虚，冲任气血不足有关。近年来有临床研究证实，补肾养血活血中药能改善子宫内膜容受性［22］，提高IVF 中COH 患者的优胚率和冻胚率［23］。本研究中，具有益气血作用的经后增殖方由八珍汤（党参、白术、茯苓、甘草、熟地黄、当归、白芍、川芎）加山萸肉、菟丝子、鹿角霜、杜仲、川椒组成。方中四君子汤补气健脾，四物汤补血养血活血，加山萸肉、菟丝子、鹿角霜、杜仲、川椒补肾填精、温阳暖宫，全方共奏补益气血、温肾助阳、养精种子之功。用现代工艺制成颗粒剂，药效稳定。本课题组早前的临床观察表明该方能提高雌激素分泌的水平，促进卵泡发育，改善卵母细胞质量，增强胚胎着床潜能，进而提高胚胎的种植率［3］。后续的动物研究提示经后增殖方能促进Bcl-2 的表达，抑制Bax 和Caspase3 的表达［24］，促进GCs 的增殖和卵丘-卵母细胞复合体的发育，并维持Bim 低表达水平［4］，从而提高COH 卵泡和胚胎质量。本研究结果显示，在COH 的基础上应用经后增殖方，能降低COH 大鼠卵巢组织p38MAPK 和NF-κB 的表达，提高CK2、IκBα 的表达，从而提高GDF9 的表达水平，降低GCs 的凋亡率，提示经后增殖方可能通过p38MAPK/CK2/IκBα/NF-κB 通路改善COH 卵细胞质量。

综上所述，经后增殖方能提高COH 大鼠卵巢GDF9 的表达，降低卵巢GCs 凋亡率，其作用机制可能是通过调控p38MAPK/CK2/IκBα/NF-κB 信号通路来实现的。本研究首次探讨了经后增殖方对p38MAPK/CK2/IκBα/NF-κB 信号通路的影响，进一步完善经后增殖方改善IVF 妊娠结局的作用机制。本文的不足之处是，尚未对p38MAPK 和NF-κB 下游效应因子进行深入研究，及经后增殖方可否通过调控其他信号通路起到相同的效果，这将是后续研究的方向。

【Author contributions】YANG Zhen designed the study， performed the experiments， wrote and reviewed the article.JIANG Shaoru designed the study.CHEN Xiaoyan and CHEN Xiaolin analyzed the data.DENG Weimin and GUO Xinyu revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

【Conflict of interest】The authors declare no conflict of interest.