橙皮苷调控EI24 Th1/Th2细胞比例对抗肺纤维化作用及可能机制研究

张 艳, 马 文, 杨 卉, 万 方

(贵州医科大学附属医院, 贵州 贵阳 550004)

肺纤维化是一种以独特的组织病理学模式为特征的异质性疾病,包括大量伴有各种肺结缔组织生长的慢性呼吸系统疾病,其中间质性肺病(ILD)和特发性肺纤维化(IPF)是最严重和不可逆的疾病,伴有肺实质进行性纤维化[1]。目前,临床上常用有氧疗法和机械通气等非药物治疗,以及吡非尼酮和尼达尼布等抗纤维化和抗氧化药物进行干预,但疗效较差。探寻治疗肺纤维化的有效药物和靶点,仍然是临床亟需解决的难题。研究表明,调节Th1/Th2平衡是纤维化疾病治疗干预的有价值战略点[2]。依托泊诱导蛋白2.4(EI24)被鉴定为p53的靶基因,能够减弱NF-κB活性,导致上皮间质转化(EMT)和炎症相关基因转录终止,延缓肺纤维化进展,且靶向EI24作为抗纤维化因子可能成为PF的新治疗方法。橙皮苷是中药陈皮中的活性成分,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫功能等多种生物学活性。既往研究已证实了橙皮苷对肝纤维化的保护作用涉及多种机制,如PI3K/Akt-Nrf2-ARE途径介导的氧化应激和炎症[3]和NF-κB途径介导的炎症反应[4]。然而,其对肺纤维化的影响及作用机制尚未完全明确。本研究旨在探讨橙皮苷对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的保护作用,并从EI24介导的ECM和Th1/Th1平衡方面探讨了相关机制。

1 材料与方法

1.1实验动物:雄性Sprague-Dawley大鼠(200g～220g,6～8周龄)从安徽金太阳药业有限公司购买,许可证号SYXK(皖)2020-007。实验动物饲养于标准实验环境,自由获取大鼠食物和水,将温度保持在20℃～22℃,湿度维持在55%,交替循环12h光照/黑暗。本研究经贵州医科大学附属医院动物伦理委员会批准(批准号:2201238)。

1.2药物与试剂:橙皮苷(≥98%,货号CFN98839)从武汉ChemFaces购买。吡非尼酮胶囊(北京康蒂尼药业有限公司,批号:H20133376),配制成0.012g/mL的混悬液备用。硫酸博莱霉素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批号:B107423),用生理盐水溶解成1mg/mL浓度的溶液备用。从上海碧云天生物技术有限公司购买转化生长因子-β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素4-(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)、I型胶原蛋白(Col-I)的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。羟脯氨酸(HYP)检测试剂盒从南京建成生化研究所获得。抗EI24抗体和抗GAPDH抗体购自美国Abcam公司。

1.3分组及模型构建:适应性喂养一周后,将60只大鼠随机分成6组,每组10只:假手术组、模型组、吡非尼酮组(阳性对照,0.12g/kg吡非尼酮)、低剂量橙皮苷组(12mg/kg)、中剂量橙皮苷组(24mg/kg)和高剂量橙皮苷组(36mg/kg)。除假手术组外,其他组采用气管内注射博莱霉素建立肺纤维化大鼠模型[5]。所有大鼠经2%戊巴比妥钠(35mg/kg)麻醉后,于气管分叉处注射博莱霉素(5mg/kg)。假手术组注射相同体积的生理盐水。注射24h后,大鼠灌胃给予吡非尼酮(0.12g/kg)或不同剂量的橙皮苷(浓度分别为12mg/kg、24mg/kg、36mg/kg),1次/d,连续28d。同时,假手术组和模型组尾静脉注射同等体积生理盐水。每周对大鼠称重。

1.4肺功能测定:最后一次给药完成后,进行肺功能测定。大鼠经2%戊巴比妥钠(35mg/kg)麻醉后,行气管切开术后气管插管,连接呼吸机,设置呼吸比为20∶10,呼吸频率为65次/min。以30cm H2O压力控制方式检测大鼠的用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气容积(FEV1)、呼气流量峰值(PEF)。

1.5标本采集:肺功能测定完成后,大鼠注射过量戊巴比妥钠后处死收集肺组织。称重肺组织后,计算肺指数:肺指数(%)=(肺重量/体重)×100%。将左肺组织固定于4%多聚甲醛溶液中用于组织学分析,右肺于冷生理盐水中清洗后,迅速冷冻于液氮中以进行生化研究。

1.6肺组织病理损伤检测:肺组织固定3d后脱水并包埋于石蜡中。将石蜡包埋的组织样本切成4μm厚的切片,随后行苏木精伊红(HE)染色和Masson染色,观察肺组织结构、炎性细胞浸润水平和肺纤维化程度。HE染色切片通过半定量组织学方法记录肺泡炎症评分,而纤维化评分则根据Masson染色切片进行分级。

1.7炎症介质和胶原蛋白水平检测:将右肺组织匀浆后,于4℃下3000r/min离心10min后获得上清液样品,置于-80℃保存。采用相关检测试剂盒检测血清TNF-α、IL-6、IL-4、TGF-β1、IFN-γ、Col I和HYP的水平。结果以ng/mg蛋白或pg/mg蛋白表示。

1.8流式细胞术检测:右肺组织匀浆后制备的细胞悬浮液于4℃、3000r/min离心5min后,弃上清,收集细胞沉淀。细胞重悬后,用FITC标记的抗CD4抗体进行细胞表面染色,经固定和透化后,用CD4-PE-Cy5抗体染色30min,用IFN-γ-PE或IL-4-FITC抗体分别对Th1或Th2细胞进行标记。用1.5%多聚甲醛固定后,上流式细胞仪测定Th1和Th2细胞的百分比。

1.9蛋白免疫印迹分析:将大鼠部分右肺组织在含PMSF和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中制备组织匀浆,冰浴后于4℃下以10000r/min离心20min。蛋白质用双喹啉酸法进行定量。蛋白质样品经12% SDS-PAGE分离后转移到聚偏二氟乙烯膜上。随后,将膜用 5%脱脂牛奶阻断2h。随后,将膜用一抗于4℃下孵育过夜。洗涤后,再将膜用过氧化物酶结合的二抗于室温下孵育2h。洗涤后,用增强化学发光检测试剂盒对膜进行显影。使用GAPDH作为内部参照。采用Image J对条带图像进行分析。

1.10实时定量PCR(qRT-PCR):用TRNzol试剂(天根生物技术,中国北京)从细胞和组织中提取总RNA。使用ReverTra Ace qPCR RT反转录试剂盒合成cDNA。根据THUNDERBIRD qPCR Mix荧光定量PCR试剂盒说明书制备20μL反应体系进行PCR扩增。热循环条件如下:在95℃下保持30s进行预变性,在95℃下保持5s、在60℃下保持30s、循环40次,在61℃下采集荧光。将CT值归一化为GAPDH,并用2-ΔΔCt法进行分析。

2 结 果

2.1橙皮苷改善肺纤维化大鼠的肺功能:对大鼠的肺功能进行测量发现,与假手术组相比,模型组的FVC、PEF、FEV明显降低(P<0.05);与模型组相比,吡非尼酮组、中剂量橙皮苷组和高剂量橙皮苷组的FVC、PEF、FEV均明显升高(P<0.05)。此外,与假手术组相比,模型组的肺指数显著升高(P<0.05);与模型组相比,中剂量橙皮苷组和高剂量橙皮苷组的肺指数明显降低(P<0.05),见表1。

表1 各组小鼠肺功能比较

2.2橙皮苷改善肺纤维化大鼠的肺组织纤维化:大鼠肺组织Masson染色显示,假手术组大鼠肺切片胶原纤维分布正常,苯胺蓝染色量较少;模型组肺泡间隔、支气管和血管周围区域蓝色胶原沉积明显;而吡非尼酮和橙皮苷处理可使胶原纤维束沉积减少。纤维化评分显示,与假手术组相比,假手术组模型组纤维化评分显著升高(P<0.05);与模型组相比,吡非尼酮组、中剂量橙皮苷组和高剂量橙皮苷组的纤维化评分显著降低(P<0.05)。进一步分析TGF-β1、Col I和HYP的水平发现,与假手术组相比,模型组肺组织中TGF-β1、Col I和HYP的含量显著假手术组升高(P<0.05);与模型组相比,吡非尼酮组、中剂量橙皮苷组和高剂量橙皮苷组肺组织中TGF-β1、Col I和HYP的含量显著降低(P<0.05)。见图1和表2。

图1 各组小鼠肺组织Masson染色(×400)

表2 各组小鼠肺组织中纤维化评分和相关标志物水平比较

2.3橙皮苷改善肺纤维化大鼠的肺组织病理损伤:HE染色可观察到,假手术组肺组织上皮结构完整,气管周围无炎细胞浸润,肺泡结构完整,大小均匀。在模型组中可观察到大量炎细胞浸润至黏膜下层和肌层、肺泡扩张融合、肺泡间隙明显增厚、肺泡直径增大等特征性病理改变。低剂量橙皮苷组的病理变化与模型组相似,但有小幅缓解;吡非尼酮组和高剂量橙皮苷组肺上皮结构基本完好,气管周围很少有炎细胞浸润,肺泡结构基本完好(图2)。肺泡炎症定量分析显示,与假手术组相比,模型组肺泡炎症评分显著假手术组升高(P<0.05);与模型组相比,吡非尼酮组、中剂量橙皮苷组和高剂量橙皮苷组的肺泡炎症评分显著降低(P<0.05)。进一步分析肺组织炎症细胞因子含量发现,与假手术组相比,模型组IL-6和TNF-α水平均显著假手术组升高(P<0.05);与模型组相比,吡非尼酮组、中剂量橙皮苷组和高剂量橙皮苷组的IL-6和TNF-α水平均明显降低(P<0.05)。见图2和表3。

图2 各组小鼠肺组织HE染色(×400)

表3 各组小鼠肺组织炎症评分和炎症细胞因子水平的比较

2.4橙皮苷促进纤维化大鼠肺组织中EI24的表达:结果发现,与假手术组相比,模型组EI24 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,中剂量橙皮苷组和高剂量橙皮苷组中EI24 mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.05)。见图3、图4、表4。

图3 各组大鼠肺组织中EI24 mRNA表达的电泳图

图4 各组大鼠肺组织中EI24蛋白的表达免疫印迹分析图

表4 各组大鼠肺组织中EI24 mRNA和蛋白表达的比较

2.5橙皮苷调节肺纤维化大鼠肺组织中Th1/Th2平衡:流式细胞术分析显示,与假手术组相比,模型组大鼠肺组织中CD4+IFN-γ+ Th1细胞亚群占比明显降低,而CD4+IL-4+ Th2细胞亚群占比明显升高(P<0.05);与模型组相比,中剂量橙皮苷组和高剂量橙皮苷组大鼠肺组织中Th1细胞亚群占比明显升高,而Th2细胞亚群占比明显降低(P<0.05)。进一步分析Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4水平发现,与假手术组相比,模型组肺组织中IFN-γ水平显著降低,而IL-4水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,中剂量橙皮苷组和高剂量橙皮苷组肺组织中IFN-γ水平显著升高,而IL-13和IL-4水平显著降低(P<0.05)。图5、图6和表5。

图5 流式细胞术检测肺纤维化大鼠肺组织Th1细胞亚群占比

图6 流式细胞术检测肺纤维化大鼠肺组织Th2细胞亚群占比

表5 各组大鼠肺组织中Th1/Th2细胞亚群占比和相应细胞因子水平的比较

3 讨 论

肺纤维化作为呼吸系统中的“类肿瘤疾病”,具有较高的病死率,严重威胁人类健康。目前,已获批的抗纤维化药物仅有吡非尼酮和尼达尼布,但仅能延缓疾病的进展,并不能完全治愈,且存在诸多不良副作用,如胃和肠道出血以及严重腹泻。因此,研究从急性肺部炎症到肺纤维化转变的分子机制,探寻多机制抗肺纤维化发展的药物,仍是目前临床研究的重点与难点。

ECM是一种在合成与降解之间动态平衡状态下机械支持肺结构的结构,由多种蛋白质和糖蛋白组成。ECM蛋白沉积增加是肺组织发生不可逆变化的明显迹象之一,可导致慢性炎症性肺部疾病(如哮喘、COPD)和IPF患者发生肺纤维化[6]。Col-I是ECM的主要成分之一,而HYP是胶原蛋白的代谢产物,当肺纤维化发生时,它们都能直接反映胶原蛋白的沉积。已证实,在肺纤维化形成过程中,Col-I通常过度表达,其过度积累是纤维化肺的重要特征之一,而抑制Col-I积累可能对肺纤维化有显著的保护作用[7]。TGF-β1作为ECM积累的主要调节因子,是纤维化的潜在关键驱动因素,已被证实参与调控肺纤维化进展中的细胞内Col-I异常沉积[8]。本研究中在模型大鼠中也观察到肺组织中TGF-β1、Col-I和HYP含量的增加。而与模型组相比,橙皮苷组大鼠肺泡炎症和肺胶原沉积的形态均有所减轻,且橙皮苷能够显著抑制Col-I的积累,提示了橙皮苷在肺组织中的抗纤维化作用。橙皮苷是一种二氢黄酮衍生物,具有多种药理作用。此外,橙皮苷通过抑制炎症和氧化应激在急性支气管炎中发挥肺保护作用[9]。在肾纤维化、肝纤维化动物模型中均观察到橙皮苷的抗纤维化作用[10]。服用博莱霉素后,大鼠肺组织中的炎症细胞浸润增加,且炎症细胞因子TNF-α和IL-6的含量也增加了。而橙皮苷可显著降低博莱霉素诱导的炎症细胞浸润和炎性细胞因子分泌,表明橙皮苷可以显著减轻博莱霉素诱导的肺部炎症。这些结果提示,橙皮苷能够抑制博莱霉素引起的ECM沉积和炎症反应,减轻肺纤维化大鼠的病理变化。

本研究发现,与模型组相比,橙皮苷组肺组织中的EI24 mRNA和蛋白表达明显升高。EI24是一种由依托泊苷以依赖于p53的方式诱导的DNA损伤应答基因,在机体多种组织中都至关重要。在小鼠神经中条件性敲除EI24会导致小鼠电传导和行为异常;在小鼠肝脏中条件性敲除EI24会导致严重肝肿大和肝细胞肥大;在小鼠胰岛中条件性敲除EI24会导致胰岛素分泌下降和血糖紊乱。此外,EI24通过促进细胞凋亡而作为肿瘤抑制因子,其低表达与乳腺癌的侵袭密切相关。有研究表明,EI24能抑制成纤维细胞分化为活化的肌成纤维细胞,减少胶原合成,增加胶原降解,从而抑制ECM蛋白在肾组织内沉积。近来研究证实,EI24在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型及TGF-β1处理的小鼠肺上皮细胞中的表达下调,而体内和体外EI24的上调可通过抑制EMT过程和ECM的产生来减弱肺纤维化。基于这些研究推测,橙皮苷可通过上调EI24转录和翻译,减少成纤维细胞向肌成纤维细胞转化以及ECM蛋白沉积。

近年来,免疫系统在肺纤维化的发生和发展过程中的作用受到广泛关注。研究表明,Th1/Th2细胞免疫反应通过影响成纤维细胞的活化、增殖和胶原沉积参与肺纤维化发展。与既往研究一致,本研究中肺纤维化小鼠表现出Th2细胞占比增多、Th1/Th2细胞失衡的现象。而橙皮苷治疗后肺纤维化小鼠肺部Th2细胞占比减少、Th1细胞占比增加,Th1/Th2细胞失衡在一定程度上得到改善。Th1/Th2平衡可通过将细胞因子IFN-γ代表Th1、IL-4代表Th2来评估。作为主要Th1细胞因子之一的IFN-γ能抑制成纤维细胞的增殖和ECM胶原蛋白的生成。在体内给予IFN-γ可导致纤维化动物模型中ECM的减少。Th2细胞因子IL-4作为一种重要的促炎细胞因子,则被证实能诱导成纤维细胞合成胶原蛋白,并在调节炎症和细胞介导的免疫反应中发挥重要作用。因此,IL-4和IFN-γ被认为是肺成纤维细胞的重要调节因子。在本研究中,与假手术组相比,模型组IFN-γ水平降低,IL-4水平增加,且IFN-γ/IL-4比率明显下降,提示Th2反应的增强和Th1反应的受限,进一步证实肺纤维化中Th1/Th2免疫细胞失衡现象。此外,与模型组相比,橙皮苷可以提高IFN-γ的水平,并逆转IFN-γ/IL-4的比例。因此,推测橙皮苷可能通过调节Th1/Th2平衡来改善博莱霉素诱导的炎症和肺纤维化。

综上所述,橙皮苷能够减弱博莱霉素诱导的大鼠炎症细胞浸润、促炎细胞因子释放和ECM过度沉积,其机制可能是通过调控EI24和Th1/Th2免疫细胞平衡来实现。因此,橙皮苷对肺纤维化具有潜在的保护作用。然而,肺纤维化发病机制复杂,仍需要进一步的研究来阐明橙皮苷潜在的作用靶点和相关机制。