SPHK1调控M2巨噬细胞极化对膀胱癌细胞上皮间质转化的机制研究

王晨静, 郭晓丹, 马振禹, 黄秀英, 张 伟

(河北省保定市第二医院病理科, 河北 保定 071000)

膀胱癌属于泌尿系统易发肿瘤,发病率及病死率均较高[1]。脂类生物因子在肿瘤远处扩散进程中发挥重要作用,其中鞘胺醇激酶1(Sphingosine kinascs-1,SPHK1)可以通过调控鞘脂代谢的平衡在肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及EMT等诸多生物学活动中发挥重要作用[2]。据报道,SPHK1通过调控肿瘤的微环境以及对EMT来诱导肝细胞癌的迁移侵袭能力,促进肿瘤转移,由SPHK1参与介导的信号通路在食管癌、结直肠癌及肝癌的远处扩散进程中发挥重要作用[3]。肿瘤微环境相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophage,TAMs)与肿瘤细胞活性密切相关,其中M2型巨噬细胞属于肿瘤间质中的非肿瘤性质的细胞亚群,发挥促进肿瘤转移的作用[4];目前SPHK1、M2型巨噬细胞极化与恶性肿瘤发展密切相关,但是二者在膀胱癌中的机制尚未阐明。本研究探讨SPHK1对M2巨噬细胞极化作用的调控以及对膀胱癌细胞EMT的影响机制,为临床研究提供基础。

1 资料与方法

1.1实验对象:选取小鼠巨噬细胞系Raw264.7及膀胱癌细胞系T24进行原代培养,选取P3代单层细胞纳入研究。

据调查发现，乡村女教师在教育目的、学生、课程、教师角色四个维度的信念得分均略高于乡村男教师，而男教师在教学信念方面的得分略高于女教师。从整体来看，男女教师的教育信念在五个维度上的差异均不显著(p>0.05)，说明其没有性别差异。

1.2主要实验试剂:杜氏改良培养基(DMEM)、胰蛋白酶购自上海玉博生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)、甘油明胶封片剂、BCA蛋白浓度测定盒、SDS-PAGE凝胶设备、电泳缓冲液、PVDF膜、ECL化学发光检测试剂盒等均购自美国Gibco公司;鼠抗人SPHK1、CD206、ArgI、Survivin、MMP-2、MMP-9、E-Cadherin、Vimentin、N-Cadherin抗体、GAPDH抗体购自美国ABC公司;辣根过氧化化物酶(HRP)标记二抗购自上海碧云天有限公司;Transwell染色剂、免疫荧光相关试剂、MTT检测试剂盒均购自美国ABC公司;LV-SPHK1、si-SPHK1慢病毒载体及阴性对照组病毒均购自上海吉凯基因有限公司。

检测到缸套内壁的表面粗糙度约Ra1.6（Rz6.3），活塞环外壁的表面粗糙度为Ra0.4（Rz1.6）。经过8h的磨合后，检测到缸套内壁的表面粗糙度约Ra0.4（Rz1.6），峰值减少值为：

1.3主要实验仪器:RT-PCR检测仪、Mini PRO型电泳仪及转膜仪、电泳槽、凝胶成像系统、超净工作台、倒置显微镜均购自美国Beckman公司,流式细胞仪、台式高速离心机、微量可调节仪器、生物组织石蜡包埋机、流式细胞仪等均购自美国Beckman公司。

本文对我馆的读者类型从两个维度进行分类：首先是不同层次的读者，包括本专科生、研究生与教职工等；其次是不同学院的读者，包括国际经贸学院、国际商务外语学院、金融管理学院、会计学院等。借助Matlab等工具对不同的读者借阅人数分布在2014—2018年的变化状况进行分析，得到的结果如图3和图4所示。

1.4.1巨噬细胞Raw264.7培养:Raw264.7置于DMEM培养基中,向培养基中添加10%胎牛血清、10mmoL/LPBS缓冲溶液及100U/mL的青霉素和链霉素,在37℃、5%CO2、适宜饱和湿度环境的细胞培养箱内进行传代培养,2～3d更换培养液,选取传代培养到第三代对数生长期的Raw264.7细胞,计数备用。

2.2SPHK1表达对巨噬细胞极化类型的影响

2.1SPHK1在巨噬细胞内转染分析:与Control-NC组相比,SPHK1在巨噬细胞内得到成功过及沉默表达,LC-SPHK1组SPHK1蛋白表达提升,si-SPHK1组SPHK1蛋白表达下调(P<0.05),见图1。*P<0.05,与Control-NC组相比。

2.3.3肿瘤细胞内增殖、侵袭相关蛋白表达:与Control-NC组相比,SPHK1过表达会提升T24细胞内Survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05);SPHK1沉默则会降低T24细胞内Survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05);SPHK1过表达可以促进膀胱癌T24细胞的迁移及侵袭能力,见图6。

采用单隐含层的BP神经网络结构，其中输入层和输出层均采用2个神经节点，隐含层采用20个神经节点。隐含层与输入层之间的传递函数为Sigmoid函数，输出层与隐含层之间的传递函数为Purelin函数。神经网络采用的训练函数为trainlm函数，最大训练历元为5 000，训练精度要求为1.0 e-8。误差曲线见图1，计算精度统计见表1。

2 结 果

1.4.3巨噬细胞Raw264.7与膀胱癌细胞系T24进行共培养:选取传代培养到第三代对数生长期的T24细胞与各组巨噬细胞系Raw264.7进行共培养,时间为48h。

图1 Western-blot检测各组巨噬细胞内SPHK1蛋白表达

1.4.2SPHK1过表达、沉默质粒转染巨噬细胞系Raw264.7:取上述第三代Raw264.7细胞系,反复吹打细胞完全消化;在3000rpm/min下离心5min后重悬处理;巨噬细胞接种到6孔板内,接种量为2mL,在37℃下培养24h,直到细胞汇合度达到30%及以上,各个孔内加入感染增强液A、P各40μL,接着加入载体SPHK1过表达(LV-SPHK1)、沉默质粒(si-SPHK1)及空白质粒(NC),均匀振荡后将放置在恒温培养箱内。12h后更换为10%的胎牛血清的DMEM培养基,慢病毒转染72h后进行项目分析。

2.2.1Western-blot检测:与Control-NC组相比,SPHK1过表达质粒转染可以上调M2巨噬细胞标志物CD206、ArgI蛋白表达(P<0.05);SPHK1沉默质粒转染可以下调M2巨噬细胞标志物CD206、ArgI蛋白表达(P<0.05),见图2。

图2 Western-blot检测各组巨噬细胞内M2型巨噬细胞标志物蛋白表达

2.3SPHK1调控M2巨噬细胞极化对膀胱癌细胞生物活性的影响

图3 免疫荧光化学分析各组巨噬细胞内M2型巨噬细胞标志物蛋白荧光强度(×200)。

2.2.2免疫荧光强度分析:与Control-NC组相比,SPHK1过表达质粒转染可以上调M2巨噬细胞标志物CD206、ArgI蛋白荧光强度;SPHK1沉默质粒转染可以下调M2巨噬细胞标志物CD206、ArgI蛋白荧光强度;提示SPHK1可以促进巨噬细胞向M2巨噬细胞极化类型转变,见图3。

2.3.1肿瘤细胞增殖活性:随着细胞培养时间的延长,各组膀胱癌T24细胞均体现出增殖活性提升趋势(P<0.05);细胞培养24h、48h以后,与Control-NC组相比,SPHK1过表达会提升T24细胞增殖活性,SPHK1沉默则会降低T24细胞增殖活性(P<0.05)见表1、图4。

表1 MTT法检测各组膀胱癌T24细胞增殖活性

图4 MTT检测各组膀胱癌细胞增殖活性

2.3.2肿瘤细胞迁移、侵袭能力分析:与Control-NC组相比,SPHK1过表达会提升T24细胞的迁移能力及侵袭能力,SPHK1沉默则会降低T24细胞迁移能力及侵袭能力(P<0.05);SPHK1过表达可以促进膀胱癌T24细胞的迁移及侵袭能力,见图5。

图5 划痕实验、Transell实验检测各组膀胱癌细胞的迁移及侵袭能力

1.4.4观察指标:①免疫荧光检测M2型巨噬细胞标志物表达:采用多聚甲醛(45g/L)固定细胞,PBS溶液进行清洗,之后加入封闭液体封闭1h,组成为0.30g BSA+5mL PBS+2.5μL Triton后将其甩干;加入1.5μL一抗(CD206:1∶1000,ArgI:1∶1000),在4℃的冰箱内孵育过夜,PBS溶液清洗三次,加入CD206、ArgI二抗(1∶500)孵育1h,采用DAPI进行染色5min,后经PBS溶液清洗后置于荧光显微镜下观察诱导结果。②Western-blot检测巨噬细胞内蛋白表达:取材后加入RIPA裂解液进行细胞悬浮液裂解处理,进行SDS-PAGE电泳分离蛋白,将检测蛋白转移到PVDF膜上,采用5%的脱脂牛奶封闭2.5h,TBST清洗3次;将PVDF膜与一抗在5℃下孵育过夜,采用TBST清洗;PVDF膜与荧光二抗孵育1.5h,,经TBST清洗后采用红外成像系统进行扫描,采用Image软件进行灰度分析;一抗稀释比例SPHK1(1∶1500)、CD206(1∶1500)、Arg-I(1∶1000)、GAPDH(1∶1500)。③MTT法检测T24细胞增殖能力:将处于对数生长期的T24细胞接种到96孔细胞培养板中,每孔约含1×104个细胞,培养24h后加入20μL(5mg/mL)MTT液,在37o室温下内培养4h,弃掉培养液;加入DMSO 150μL,震荡培养,采用酶标仪对其光密度OD(波长450nm)进行检测,计算细胞增殖能力。④划痕实验检测细胞迁移能力:移取10mg已灭菌处理的蒸馏水,将蒸馏水定容于规格为100mL的容量瓶后,获得1mg per m的5-氟尿嘧啶溶液;移液器获取50mL剂量的5-氟尿嘧啶溶液,使单层细胞出现一字划痕,加入预先配置获得的5-氟尿嘧啶溶液;利用显微镜完成取图,进行分析。⑤Transwell实验检测细胞侵袭能力:将处于对数生长期的细胞采用PBS漂洗三次,制备单细胞悬浮液,5×105个细胞/mL,台盼蓝染色。在Transwell培养板上接种100μL细胞悬浮液,加入无血清培养基200μL。培养24h后,采用湿棉签擦去Matrigel凝胶和聚碳酯膜表面的细胞,取出上室,用线拴住,做好标记;苏木素染色1min,梯度乙醇脱水(70～100%),二甲苯透明;在高倍镜下随机取6个视野,计算平均数。⑥Western-blot检测细胞内相关蛋白表达:其中一抗稀释比例Survivin(1∶1500)、MMP-2(1∶1500)、MMP-9(1∶1000)、E-Cadherin(1∶1500)、Vimentin(1∶1500)、N-Cadherin(1∶1500)、GAPDH(1∶1500),其余步骤同②所示。

图6 Western-blot检测各组膀胱癌T24细胞内凋亡相关蛋白表达

2.3.4肿瘤细胞内EMT相关蛋白表达:与Control-NC组相比,SPHK1过表达会提升T24细胞内Vimentin、N-Cadherin蛋白表达,降低E-Cadherin蛋白表达(P<0.05);SPHK1沉默则会降低T24细胞内Vimentin、N-Cadherin蛋白表达,提升E-Cadherin蛋白表达(P<0.05);SPHK1过表达可以促进膀胱癌T24细胞EMT进程,见图7。

1.4方 法

图7 Western-blot检测各组膀胱癌T24细胞内EMT相关蛋白浓度表达

3 讨 论

现代医学肿瘤学的研究发现,膀胱癌的病理发展及远处扩散是一个复杂的病理过程,受到诸多因素影响[5]。鞘磷脂的活性代谢产物鞘氨醇激酶1(SPHK1)属于调节体内鞘磷脂代谢的关键酶类物质之一,在多种实体肿瘤中呈现高表达趋势。肿瘤局部微环境可以调节巨噬细胞极化,进而促进TAMs向促肿瘤方向的M2型极化,在多种肿瘤组织中的TAMs均具有M2型巨噬细胞的特征[6]。SPHK1可以调控肿瘤微环境内细胞成分改变,但是否对巨噬细胞的极化类型及发展趋势具有影响目前涉及较少[7]。本论文结果SPHK1在巨噬细胞内得到成功过表达或者沉默处理,SPHK1的过表达可以促进M2型巨噬细胞标志蛋白CD206及ArgI的表达及荧光强度,反之亦然,由此看出,SPHK1可以促进M2细胞的极化比例,对肿瘤细胞发挥相应的生物学作用。

狗蛋匆匆跑下山，任山谷里的野风在耳边吟唱。他笑了，在外学习四年后终于毫不遮挡地笑了，那爽朗的笑声和在风中更加悦耳。

肿瘤细胞的增殖、转移是影响患者预后的关键因素之一,SPHK1的表达不仅可以改变脂类分子的动态平衡,亦可以影响肿瘤细胞的周期[8]。研究结果显示,SPHK1的过表达可以促进膀胱癌细胞的增殖,反之亦然;SPHK1的过表达亦可以促进肿瘤细胞的迁移及侵袭能力,上调细胞迁移侵袭蛋白MMP-2、MMP-9的表达,可以总结到,SPHK1通过影响提升M2巨噬细胞的极化来促进膀胱癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,为膀胱肿瘤的远处扩散提供病理基础。

利用筛选出的13对引物，对缺齿蓑藓11个居群106份样品进行PCR扩增，获得了150个位点，其中148个为多态位点。11个居群的多态位点百分率为45.95% ～ 81.08%，其中最高的是浙江温州乌岩岭居群，最低的是浙江金华大盘山居群，物种总多态位点百分率为98.67%。

转移是癌症进展的关键性标志之一,细胞外基质的降解、EMT、肿瘤血管的生成、肿瘤微环境的改善等均会导致肿瘤的进展[9]。EMT的存在使得癌细胞更加具有侵略性,进而体现出更加强烈的侵袭性。目前靶向EMT信号通路可以给与癌症治疗起到重要理论支持[10]。SIP信号通路可以对肿瘤细胞EMT做出应答,SPHK1可以通过加速E-Cadherin溶酶体的降解来促进肝癌细胞的侵袭及转移,进而诱导EMT,同时SPHK1的过表达可以增强肿瘤的发生,刺激癌细胞的生长、血管的生成、增殖及存活进程[11]。本研究结果显示,T24细胞内SPHK1的过表达可以促进肿瘤细胞的EMT,提升Vimentin、N-Cadherin蛋白表达,降低E-Cadherin蛋白表达;反之亦然;上述的数据再次提示SPHK1在膀胱癌EMT中发挥重要的作用,SPHK1通过促进EMT进程来促进肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭能力,最终促进肿瘤的远处扩散能力。

综上我们得出,SPHK1过表达可以提升M2型巨噬细胞极化程度,促进膀胱癌肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力及EMT进程,最终提升膀胱癌的远处扩散能力;在后续的研究中我们将致力于进一步探究表观遗传学-免疫因素与肿瘤进展中的作用机制,为更多的癌症患者的临床治疗提供理论基础。