槐耳多糖调节SPHK1/S1P/S1PR3信号通路对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响

李丽品, 马素艳, 安入征

(河北省石家庄市平安医院肿瘤科, 河北 石家庄 050000)

宫颈癌是妇女最常见的癌症之一,其发病率和死亡率在女性恶性肿瘤中排名第四。由于其持续耐药和反复复发,患者预后较差[1]。因此寻求新的治疗药物对宫颈癌的治疗至关重要。近年来,中草药在癌症治疗中被广泛研究,槐耳(Trametes robiniophila Murr)作为一种传统中草药被广泛应用于许多疾病,近年来,槐耳被广泛应用于抗肿瘤药物的研究,槐耳多糖(Huaier polysaccharide,HP)是槐耳提取物,可增强机体免疫、抗氧化、抗炎反应,其在胃癌、乳腺癌等多种癌症中可促进细胞凋亡,表现出良好的抗肿瘤作用[2],但其在宫颈癌中抗癌作用及机制尚不清楚。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)是鞘脂代谢的中心分子,决定细胞的命运,由鞘脂苷通过两种酶(鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPHK1),鞘氨醇激酶2(sphingosine kinase 2,SPHK2)产生,S1P与5种G蛋白偶联受体(S1PR1-5s)结合,在调节细胞存活、迁移等过程中起着至关重要的作用[3]。研究显示SPHK-S1P-S1PRs信号通路在细胞增殖生长中发挥作用,SPHK1的过度激活可能促进肿瘤的发生和发展[4-5]。宫颈癌中SPHK1高表达,沉默SPHK1宫颈癌细胞细胞活性、增殖能力显著降低,细胞凋亡率显著升高。槐耳多糖影响宫颈癌发生机制是否与SPHK1/S1P/S1PR3信号通路有关尚不清楚。本研究基于SPHK1/S1P/S1PR3信号通路,探究槐耳多糖对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响及机制,为宫颈癌治疗提供理论参考。

1 材料与方法

1.1材料:人宫颈癌细胞HeLa(CL-0101)购自武汉普诺赛生命科技有限公司;槐耳多糖(Huaier polysaccharide,HP)(S28138)购自上海源叶生物科技有限公司;SPHK1激活剂K6PC-5(E1218)购自Selleck公司;RPMI 1640培养基(11875176)购自赛默飞公司;MTT试剂盒(CT0002)购自山东思科捷生物技术有限公司;Edu细胞增殖试剂盒(E-CK-A377)购自武汉伊莱瑞特公司;一抗Snail(A5243)、N-cadherin(A3045)、E-cadherin(A3044)、SPHK1(A0139)、S1PR3(A1404)、GAPDH(AC001)购自ABclonal公司;一抗S1P(ab59870)及二抗山羊抗兔IgG(ab205718)购自Abcam公司。

1.2方 法

1.2.1细胞培养及MTT检测细胞活力:HeLa细胞于RPMI 1640培养基(添加10%胎牛血清)中培养(37℃,5% CO2),并进行消化传代,当细胞合流度达到90%时,进行实验。细胞接种于96孔板。孵育过夜后,用不同浓度(0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)的槐耳多糖溶液替换培养基,24、48和72h后加入MTT溶液,孵育4h。随后,每孔中的溶液小心用DMSO替换10min。在酶标仪中490nm波长下读取吸光度值,并计算细胞活力。

1.2.2分组及处理:将对数生长期细胞分为对照组(Control组)、槐耳多糖低、中、高浓度组(HP-L、HP-M、HP-H组)和槐耳多糖高浓度+SPHK1激活剂K6PC-5组(HP-H+K6PC-5组)。HP-L、HP-M、HP-H组分别使用50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL槐耳多糖溶液处理细胞24h,HP-H+K6PC-5组使用200μg/mL槐耳多糖溶液和10μM的K6PC-5共处理细胞24h。

1.2.3Edu检测细胞增殖:按照1.2.2中的分组处理细胞,并接种于96孔板(4.0×104/孔)培养24h,去除培养基后,用Edu处理2h。丢弃含有Edu的培养基后,用4%甲醛和0.5% Triton X-100溶液固定细胞透化细胞,DAPI对细胞核进行染色,荧光显微镜下观察Edu阳性细胞数,并计算Edu阳性细胞率。

1.2.4细胞迁移和侵袭能力检测:将各组细胞接种于24孔板中,当细胞达到约90%汇合时,用移液管吸头刮擦细胞单层以形成均匀划痕,用无血清磷酸盐缓冲液冲洗后将在无血清培养基中培养。光学显微镜下拍照观察0h和24h划痕的融合情况,并计算细胞划痕愈合率。使用24孔Transwell装置进行体外侵袭试验,上腔接种各组细胞(1×104/mL),下腔为10%胎牛血清的培养基。1d后,通过多聚甲醛和结晶紫对下室的侵袭的细胞进行固定、染色,光学显微镜拍照观察,并计算侵袭细胞数量。

1.2.5Western blot检测蛋白水平:收集处理后的细胞,裂解缓冲液中裂解。经10% SDS-PAGE电泳分离、转膜、封闭后,与一抗SPHK1、S1P、S1PR3、Snail、N-cadherin、E-cadherin及GAPDH过夜孵育(4℃)。后与相应二抗孵育1h(室温)。ECL进行显影,Image J计算蛋白条带灰度值。

2 结 果

2.1槐耳多糖对宫颈癌细胞活力的影响:不同浓度HP处理宫颈癌细胞24、48、72h后,细胞活力逐渐降低,除25μg/mL处理浓度外,其与各浓度处理的细胞活力显著降低(P<0.05)。为保证一定存活率,选择50、100、200μg/mL的HP用于后续研究。见图1。

图1 槐耳多糖对宫颈癌细胞活力的影响

2.2槐耳多糖对宫颈癌细胞增殖的影响:与Control组比较,HP-L组、HP-M组和HP-H组细胞Edu阳性率依次降低(P<0.05)。与HP-H组比较,HP-H+K6PC-5组细胞Edu阳性率显著升高(P<0.05),见图2、3。

图2 Edu检测各组细胞增殖情况(×200)

图3 槐耳多糖对宫颈癌细胞增殖的影响

2.3槐耳多糖对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响:与Control组比较,HP-L组、HP-M组和HP-H组细胞侵袭数、划痕愈合率依次降低(P<0.05)。与HP-H组比较,HP-H+K6PC-5组细胞侵袭数、划痕愈合率显著升高(P<0.05),见图4、图5、图6。

图4 划痕愈合实验检测各组细胞迁移能力

图5 Transwell小室实验检测各组细胞侵袭能力(×200)

图6 槐耳多糖对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响

2.4槐耳多糖对宫颈癌细胞E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白水平的影响:与Control组比较,HP-L组、HP-M组和HP-H组E-cadherin水平依次升高,N-cadherin、Snail水平依次降低(P<0.05)。与HP-H组比较,HP-H+K6PC-5组E-cadherin水平显著降低,N-cadherin、Snail水平显著升高(P<0.05),见图7、8。

图7 Western blot检测各组细胞EMT相关蛋白水平

图8 槐耳多糖对宫颈癌细胞E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白水平的影响

2.5槐耳多糖对宫颈癌细胞SPHK1、S1P、S1PR3蛋白水平的影响:与Control组比较,HP-L组、HP-M组和HP-H组SPHK1、S1P、S1PR3蛋白水平依次降低(P<0.05)。与HP-H组比较,HP-H+K6PC-5组SPHK1、S1P、S1PR3蛋白水平显著升高(P<0.05),见图9、10。

图9 Western blot检测通路相关蛋白水平

图10 槐耳多糖对宫颈癌细胞SPHK1、S1P、S1PR3蛋白水平的影响

3 讨 论

宫颈癌是全世界妇女癌症死亡的第四大原因,由于其高发病率和死亡率,对有效的诊断、治疗和预防药物的需求未得到满足,虽然放疗和化疗等方式在宫颈癌上取得了较好的治疗效果,但耐药性的产生使患者预后较差[6]。

槐耳多糖是一种由6个单糖和18个氨基酸组成的活性成分,是中草药槐耳的主要提取物,对癌细胞具有抑制作用[7]。本研究结果显示槐耳多糖处理HeLa细胞后,细胞活力、增殖能力均降低,与前人研究结果相似[8]。表明槐耳多糖具有抑癌作用,可降低宫颈癌细胞活力,抑制其增殖。上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在癌症的进展、侵袭、迁移中起着关键作用,上皮细胞通过失去细胞极性和上皮标记物(E-cadherin)的表达发生表型转换,通过获得间充质标记物(N-cadherin,Snail)的表达成为间充质细胞,表现出细胞间粘连减少和运动性增加,因此E-钙粘蛋白的丢失,是EMT过渡过程中的关键步骤[9]。有研究表明槐耳多糖可通过抑制EMT抑制癌细胞的增殖、转移和侵袭[10]。本研究中槐耳多糖处理后HeLa细胞N-cadherin、Snail水平降低,E-cadherin蛋白上调,其迁移及侵袭能力受到抑制,与雷蕾等研究结果相似[11]。表明槐耳多糖可能通过抑制EMT进展抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移。

据报道SPHK1/S1P/S1RP3信号通路在癌细胞的增殖、迁移、侵袭和转移及肿瘤血管生成中起重要作用[12]。有研究表明SPHK1在大多数癌症中普遍表达,SPHK1的过度激活促进了肿瘤的发生和发展,SPHK1是S1P合成的主要酶,控制着S1P的水平,在癌细胞的增殖、迁移、侵袭和肿瘤血管生成中起重要作用[13]。Zhang[14]等研究表明SPHK1/2的过度表达和/或过度激活在宫颈癌的发生和发展中具有重要作用,通过抑制SPHK表达能抑制细胞活力、集落形成、增殖、迁移及细胞周期进展。本研究中细胞SPHK1、S1P、S1PR3水平随着槐耳多糖浓度的增加依次降低,同时其增殖、迁移、侵袭能力受到抑制。而激活剂K6PC-5逆转了槐耳多糖对细胞增殖、侵袭、迁移及SPHK1/S1P/S1RP3信号通路的抑制作用。表明槐耳多糖能抑制宫颈癌细胞恶性生物学行为的发生,其机制可能与抑制SPHK1/S1P/S1RP3信号通路传导有关。

综上所述,槐耳多糖对宫颈癌细胞有显著抑制作用,其作用机制可能与抑制SPHK1/S1P/S1RP3信号通路传导有关。本文初步探究了槐耳多糖对宫颈癌细胞的影响,其机制复杂,且本研究未在体内进行验证,今后仍需进行深入研究并在体内进行验证,为槐耳多糖在宫颈癌的治疗应用上提供参考。