鸦胆子结合吡柔比星对膀胱癌细胞作用的影响

孙士恒，夏似龙，张博，周大宏

黑龙江省医院泌尿一科，黑龙江哈尔滨 150036

膀胱癌为泌尿系常见恶性肿瘤。该病发病原因复杂，一般认为与内在、外在因素共同作用引发有关，以血尿、排尿障碍为主要临床表现[1]。吡柔比星（Pirarubicin）为该病主要抗肿瘤药物[2]。但在用药治疗期间存在肿瘤细胞耐药情况，影响患者病情控制效果，威胁其生命安全。鸦胆子是一种清热解毒药。现代药理研究发现，鸦胆子油乳具有抗炎、杀菌、止痛等作用[3]。有研究发现，在对膀胱癌患者治疗中，通过基因水平靶向调控作用，可提升肿瘤细胞药物敏感性[4]。核因子κB（Nuclear Factor Kappa-B，NF-κB）为化疗中诱导细胞耐药重要环节，经上游信号通路启动DNA合成，促进细胞增殖，诱导恶性肿瘤进展[5]。腺苷三磷酸（Adenosine Triphosphate, ATP）结合转运蛋白G家族成员2（ATP-binding Cassette Superfamily G member 2，ABCG2）为细胞膜表面蛋白，其表达上调可能会增强ATP将药物从细胞内向细胞外转移能力，增加细胞耐药性[6]。为此，选取2023年4—5月期间黑龙江省医院泌尿科1株人BIU-87膀胱癌细胞株为研究对象，分析鸦胆子油乳对膀胱癌细胞增殖、凋亡及耐药情况影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

研究所用细胞及主要试剂见表1。本次研究经本院医学伦理委员会审核批准通过（SYYLLBA2022041）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及预处理 人BIU-87膀胱癌细胞，接种于RPMI-1640培养液中（包含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、10%胎牛血清），5%CO2、37℃、湿度100%环境培养。取对数生长期细胞，0.15%胰酶+0.1乙二胺四乙酸（Ethylenediamine Tetraacetic Acid，EDTA）消化处理制成单细胞悬液；细胞计数，以1×106/L浓度接种培养瓶中继续培养；细胞生长至半融合状态时进行预处理：细胞恒温孵育（水浴，42℃，30 min），移出细胞后培养（5%CO2、37℃、湿度100%）24 h时进行实验。

1.2.2 分组情况 将细胞以5×104个/mL接种于96孔板中，100 μL/孔；设置1组空白对照，均添加吡柔比星，浓度为5 μmol/L，并分别加入0、5、10、20、30 mL/L浓度鸦胆子油乳，培养24 h时进行实验研究。

1.2.3 细胞增殖抑制率观察 每孔加20 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h后终止培养，弃上清，每孔加100μL 二巯基丁二酸（Dimercaptosuccinic Acid, DMSA），振荡使晶体溶解后，酶标仪492 nm处读取吸光值（D），计算细胞增殖抑制率（Proliferation Inhibition Rate，IR）；IR=（1-D试验孔/D对照孔）。

1.2.4 细胞凋亡情况观察 使用凋亡检测试剂盒检测。细胞以0.12%胰酶消化，磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline，PBS）洗涤2次后，加入200 μL结合缓冲液混匀后，加10 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）避光染色15 min，应用流式细胞仪检测，利用Cellquest软件分析细胞坏死及凋亡情况，统计记录细胞坏死率、凋亡率。

1.2.5 细胞周期情况 取各组细胞，弃上清，PBS冲洗2次，70%冷乙醇中重悬过夜固定（4℃）；检测前离心（离心条件：1 000 r/min，10 min），弃上清，PBS洗涤2次，加25 μL 2 mg/mL核糖核酸酶A，37℃下静置30 min，加25 μL PI染料，避光染色30 min，经流式细胞仪检测确定细胞周期。

1.2.6 NF-кB表达情况 以Western印迹法检测NF-кB表达情况，即依据细胞质、细胞核蛋白分离抽提试剂盒说明书进行蛋白质提取。每组蛋白样本定量后，各取30 μg进行不连续10% SDS-PAGE，电转移至硝酸纤维膜后，以5%脱脂奶粉室温封闭（1 h），加1 ∶ 1 000稀释的兔抗人NF-кB/p65多克隆抗体、β-action多克隆抗体（细胞质内参）、1:500稀释的兔抗人TBP多克隆抗体（细胞核内参），4℃过夜。加1 ∶ 3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为一抗，室温孵育2 h，加电化学发光试剂，X线胶片曝光并扫描，以Quantity One v4.62凝胶定量软件分析蛋白条灰度值，通过细胞核、细胞质内参统计细胞核、细胞质中NF-кB蛋白相对表达水平，以对照组比值为100%标准化处理后，对各组蛋白表达量半定量分析。

1.2.7 ABCG2表达情况 以Western印迹法检测ABCG2表达情况。与“1.2.6”中相同方法提取总蛋白后，以二喹啉甲酸（Bicinchoninic Acid，BCA）法定量40 μg样品上样，以SDS-PAGE法分离蛋白质，以5%脱脂奶粉室温封闭（1 h），添加ABCG2一抗，4℃过夜，添加ABCG2二抗孵育1 h，加电化学发光试剂，X线胶片曝光并扫描，以Quantity One v4.62凝胶定量软件分析蛋白条灰度值，以GAPDH为内参，统计细胞膜上ABCG2相对表达水平，蛋白定量方法与“1.2.6相同”。

1.3 质量控制

每组细胞均进行3个平行样本，每个样本细胞均设置5个复孔（每组共计15个样本量）；每个样本重复检测3次，取3次检测结果平均值。

1.4 统计方法

采用SPSS 24.0统计学软件分析数据，细胞增殖抑制率、坏死率、凋亡率、细胞周期、NF-кB、ABCG2表达为计量资料，符合正态分布，以(±s)表示，行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度鸦胆子油乳对BIU-87细胞增殖抑制率、坏死率、凋亡率影响

随鸦胆子油乳浓度升高，BIU-87细胞增殖抑制率、坏死率、凋亡率逐渐升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）；鸦胆子油乳浓度为5 mL/L时细胞增殖抑制率、细胞坏死率显著提升，浓度≥10 mL后，细胞凋亡率显著提升，差异有统计学意义（P均＜0.05），见表2。

表2 不同浓度鸦胆子油乳对BIU-87细胞增殖抑制率、坏死率、凋亡率影响[(±s)，%]

表2 不同浓度鸦胆子油乳对BIU-87细胞增殖抑制率、坏死率、凋亡率影响[(±s)，%]

注：细胞增殖抑制率中，不同鸦胆子油乳浓度比较，①P＜0.05；与鸦胆子油浓度为0时细胞增殖抑制率比较，②P＜0.05；坏死率中，不同鸦胆子油乳浓度比较，③P＜0.05；与鸦胆子油浓度为0时坏死率比较，④P＜0.05；凋亡率中，不同鸦胆子油乳浓度比较，⑤P＜0.05；与鸦胆子油浓度为0、5 mL/L时凋亡率比较，⑥P＜0.05。

凋亡率（3.62±0.75）⑤（4.10±1.03）⑤（15.52±2.79）⑤⑥（17.14±2.05）⑤⑥（19.07±2.44）⑤⑥鸦胆子油乳浓度0（n=15）5 mL/L（n=15）10 mL/L（n=15）20 mL/L（n=15）30 mL/L（n=15）细胞增殖抑制率（5.41±1.20）①（55.71±6.79）①②（71.88±7.20）①②（75.43±6.23）①②（80.15±7.15）①②坏死率（6.63±1.35）③（35.49±5.31）③④（29.33±4.29）③④（30.30±6.72）③④（31.35±5.88）③④

2.2 不同浓度鸦胆子油乳对BIU-87细胞周期影响

随鸦胆子油乳浓度升高，BIU-87细胞中S期细胞占比降低，C0/C1期细胞占比升高，差异有统计学意义（P均＜0.05），见表3。

表3 不同浓度鸦胆子油乳对BIU-87细胞周期影响[(±s)，%]

注：S期中，不同鸦胆子油乳浓度比较，①P＜0.05；C0/C1期中，不同鸦胆子油乳浓度比较，②P＜0.05。

C0/G1期（51.20±7.51）②（68.42±5.32）②（71.55±6.40）②（75.54±4.83）②（82.79±5.24）②鸦胆子油乳浓度0（n=15）5 mL/L（n=15）10 mL/L（n=15）20 mL/L（n=15）30 mL/L（n=15）S期（42.53±3.16）①（25.41±2.88）①（21.21±3.02）①（18.43±2.10）①（14.02±1.95）①

2.3 不同浓度鸦胆子油乳对BIU-87细胞NF-кB、ABCG2表达情况影响

随鸦胆子油乳浓度升高，细胞质中NF-κB表达量逐渐下降，细胞核中NF-κB表达量逐渐升高，细胞膜表面ABCG2表达量下降，差异有统计学意义（P均＜0.05），见表4。

表4 不同浓度鸦胆子油乳对BIU-87细胞NF-кB、ABCG2表达情况影响[(±s)，%]

表4 不同浓度鸦胆子油乳对BIU-87细胞NF-кB、ABCG2表达情况影响[(±s)，%]

注：细胞质中NF-кB表达量中，不同鸦胆子油乳浓度比较，①P＜0.05；细胞核中NF-кB表达量中，不同鸦胆子油乳浓度比较，②P＜0.05；细胞膜中ABCG2表达量中，不同鸦胆子油乳浓度比较，③P＜0.05。

细胞膜中ABCG2表达量（1.32±0.11）③（0.95±0.21）③（0.76±0.12）③（0.54±0.07）③（0.43±0.08）③鸦胆子油乳浓度0（n=15）5 mL/L（n=15）10 mL/L（n=15）20 mL/L（n=15）30 mL/L（n=15）细胞质中NFкB表达量（0.89±0.21）①（0.60±0.15）①（0.48±0.10）①（0.45±0.08）①（0.37±0.11）①细胞核中NFкB表达量（0.86±0.15）②（2.21±0.30）②（2.44±0.57）②（2.52±0.38）②（2.70±0.44）②

3 讨论

吡柔比星为膀胱癌主要治疗药物，通过将肿瘤细胞停滞在G2细胞期来抑制细胞分裂过程，促进细胞凋亡。在对膀胱癌治疗中，吡柔比星膀胱热灌注治疗可通过其热效应增加与肿瘤细胞接触，以控制膀胱癌进展，降低肿瘤临床分期，且局部灌注治疗可降低化疗药物全身性不良反应，提升治疗安全性[7]。但在应用吡柔比星治疗中，部分患者存在药物治疗敏感性差，或吡柔比星耐药情况，使患者出现病情反复、原位肿瘤控制不理想等情况，影响预后。因此在对膀胱癌患者应用吡柔比星治疗基础上，如何联合用药可提升患者化疗药物敏感性，为目前研究关键。

鸦胆子属中药饮片，其中鸦胆子油乳主要成分为油酸及亚油酸[8]。有研究发现，鸦胆子油乳能够抑制肿瘤细胞DNA合成，破坏肿瘤细胞生物膜结构，抑制肿瘤内部血管新生，因此起到抗肿瘤作用[9-10]。而将其应用于接受吡柔比星热灌注治疗的膀胱癌患者中，是否可起到协调作用、增强患者对吡柔比星药物敏感性研究较少。本次研究结果显示，与单纯应用吡柔比星（鸦胆子油乳浓度为0时）相比，联合不同浓度鸦胆子油乳，均会增强肿瘤细胞增殖抑制作用，并促进肿瘤细胞坏死及凋亡，分析原因为，鸦胆子苦醇可抑制NRF2基因表达，以抑制肿瘤细胞增殖过程，促进肿瘤细胞凋亡[11]，通过RhoA/RO CK1信号通路抑制肿瘤细胞迁移及侵袭[12]，同时可通过Nrf2/HO-1通路诱导铁死亡，以促进肿瘤细胞凋亡[13]，可能为联合鸦胆子油乳后对肿瘤细胞增殖抑制、促进细胞凋亡影响因素之一。同时在本次研究中发现，低浓度鸦胆子油乳可促进肿瘤细胞损伤，高浓度则促进肿瘤细胞凋亡，而经肿瘤增殖抑制作用中可见，其对肿瘤细胞作用过程存在剂量依赖性。

本次研究结果显示，随鸦胆子油乳浓度升高，BIU-87细胞中S期细胞占比降低，C0/C1期细胞占比升高（P均＜0.05），且随鸦胆子油乳浓度升高，细胞质中NF-κB表达量逐渐下降，细胞核中NF-κB表达量逐渐升高（P均＜0.05），考虑原因为，NF-κB是一种控制DNA转录的蛋白质复合物，在机体炎症反应、恶性肿瘤后，其在细胞核中大量合成分泌到细胞质中，用于参与细胞增殖、分化及凋亡，并促进血管新生[14]；联合鸦胆子油乳后，该药本身会造成肿瘤细胞损伤、干扰肿瘤细胞增殖过程，加速吡柔比星经细胞外间质进入细胞内，参与至肿瘤细胞DNA中，抑制细胞增殖分裂过程，将细胞停滞在C0/G1期，抑制细胞核对NF-κB合成作用，进而降低NFκB从细胞核向细胞质分泌过程，促进细胞对NFκB稳定分泌能力，降低细胞质中NF-κB水平，并抑制细胞增殖分裂[15-16]。

本次研究结果显示，随鸦胆子油乳浓度升高，细胞膜表面ABCG2表达量下降，考虑原因为，ABCG2为细胞膜表面蛋白，其表达水平上调会通过ATP向细胞外排出药物成分；应用鸦胆子油乳后可下调ABCG2表达过程，关闭药物成分经细胞膜排出通道，增强吡柔比星对肿瘤细胞DNA作用能力；而随鸦胆子油乳浓度增加，其对ABCG2表达下调控制能力增强，而经本实验室研究结果得出，miR-144-3p与ABCG2具有直接靶向关系，提示鸦胆子油乳可能对miR-144-3P具有上调作用，使肿瘤细胞对吡柔比星持续表达出高度药物敏感性，可能为该药浓度升高后肿瘤增殖抑制能力增强、损伤凋亡数量增加主要影响因素[17]。付皓云等[18]在其研究中发现，鸦胆子油乳（40 mg/L）可显著抑制食管鳞状癌细胞增殖[（4.48±0.08）% vs（6.61±0.12）%]，促进肿瘤细胞凋亡[（19.60±3.15）% vs（5.37±1.20）%]，与本次研究的[（80.15±7.15）% vs（5.41±1.20）%]、[（19.07±2.44）% vs（3.02±0.45）%]结果一致。但本次研究重点为鸦胆子油对吡柔比星治疗耐药机制影响，可为该病临床方案制订提供更准确参考依据。

综上所述，鸦胆子油乳结合吡柔比星，可抑制BIU-87膀胱细胞株增殖，低浓度可促进细胞坏死，高浓度可促进细胞凋亡，并降低细胞质中NF-κB表达量，抑制ABCG2表达，其效果均存在剂量依赖性。