鸦胆子油乳对肺癌A549细胞顺铂化疗的增敏作用及其机制

易飞，刘蕾，张军

1 成都市第三人民医院药学部，成都 610031；2 成都市第三人民医院实验医学部；3 成都市第三人民医院肿瘤二科

鸦胆子为枯木科鸦胆子属灌木或小乔木的干燥成熟果实，鸦胆子油乳是以鸦胆子石油醚提取物为原料，以精制大豆磷脂为乳化剂制成的水包油乳［1］。作为目前临床常用的中药抗癌药物之一，鸦胆子油乳多用于肺癌、肺癌脑转移及消化道恶性肿瘤的治疗［2］。王权等［3］在鸦胆子油乳联合含铂类一线化疗方案治疗非小细胞肺癌的Meta 分析中发现，鸦胆子油乳联合含铂类化疗能提高非小细胞肺癌的肿瘤控制率，提高患者的化疗效果。目前关于鸦胆子油乳可提高铂类化疗药物临床疗效的观察研究较多，但该药是否与铂类药物有协同作用的基础研究较少。2022年1月—12月，本课题组在肺癌A549细胞株中观察了鸦胆子油乳与顺铂的协同抗肿瘤效应，探讨鸦胆子油乳是否对肺癌A549 细胞顺铂化疗具有增敏作用并分析其可能机制，以期为临床肺癌化疗的治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人肺癌A549 细胞株（中科院典型培养物保藏中心细胞库）。注射用顺铂（江苏豪森药业股份有限公司），鸦胆子油乳注射剂（沈阳药大药业责任有限公司）。RPMI 1640 培养基、胰蛋白酶（美国HyClone 公司），CCK-8 试剂盒、活性氧检测试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒（北京Biosharp 公司），荧光双染凋亡试剂盒（苏州四正柏生物科技有限公司）。酶联免疫检测仪（美国Perkin Elmer 公司）、流式细胞仪（美国Beckman Coulter 公司）、荧光显微镜（德国Leica公司）。

1.2 细胞的药物敏感性观察 人肺癌细胞A549培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱中传代培养。取对数生长期细胞，制备成单细胞悬液接种于96孔培养板，每孔 100 µL，常规培养48 h 后分别加入100 µL以培养液稀释的药物。鸦胆子油乳设5个梯度浓度（625、313、156、78、39 µg/mL），顺铂亦设置5个梯度浓度（5.00、2.50、1.25、0.62、0.31 µg/mL）［4-5］，每个药物浓度设置3 个复孔，同时设置不接种细胞的空白对照孔及不加药物的对照孔。加药后继续培养48 h，加入20 µL MTT，酶标仪检测570 nm 处各孔光密度（OD）值，取各复孔OD 值的平均值计算各浓度药物对细胞生长的抑制率。抑制率=（对照孔OD值-实验孔OD 值）/对照孔OD 值×100%，根据抑制率计算药物对细胞的半数抑制浓度（IC50）。IC50越低，说明细胞对药物越敏感。MTT 试验结果显示，鸦胆子油乳及顺铂的IC50分别为（58.47 ± 6.87）、（1.98 ± 0.31）µg/mL。根据两种药物的IC50，进一步采用MTT 法观察不同浓度鸦胆子油乳对顺铂IC50的影响。分别将2.44、9.77、78.12 µg/mL的鸦胆子油乳加入2.50、1.25、0.62、0.31、0.16 µg/mL 的顺铂中，MTT 法检测各浓度药物对细胞生长的抑制率，计算顺铂的IC50。

1.3 细胞分组及处理 取对数生长期A549 细胞，常规胰酶消化成单个细胞悬液，以1 × 104/孔接种于6 孔板，于培养箱内孵育过夜。细胞贴壁后，将细胞分为对照组、鸦胆子油乳组、顺铂组及鸦胆子油乳+顺铂组，根据“1.2”中得到的鸦胆子油乳及顺铂IC50的1/2 确定药物处理浓度，即鸦胆子油乳组以30 µg/mL鸦胆子油乳单药处理，顺铂组以0.75 µg/mL顺铂单药处理，鸦胆子油乳+顺铂组以30 µg/mL 鸦胆子油乳及0.75 µg/mL顺铂联合处理，对照组不做处理正常培养细胞。

1.4 细胞形态及生长情况观察 各组细胞继续培养48 h后，使用70%冷乙醇固定，以1 µg/mL的碘化丙啶（PI）染色，倒置荧光显微镜下观察细胞形态及生长情况。

1.5 细胞周期检测 采用流式细胞术。各组细胞继续培养48 h后，0.25%胰酶消化收集细胞，70%冷乙醇固定细胞后，以1 µg/mL 的PI 染色液及10 µL RNase A（50×）混匀，放置于37 ℃环境下避光反应30 min，采用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期。1.6 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。各组细胞继续培养48 h 后，用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化细胞并收集，将细胞悬液加入5µL Annexin V-FITC 避光孵育5 min 后，再加入10 µL PI，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.7 细胞内ROS 水平检测 采用二氯荧光素二乙酸酯（H2DCFDA）荧光探针染色。取培养48 h 的各组细胞，在37 ℃下加载H2DCFDA 30 min，收集细胞并通过流式细胞仪在530 nm 波长处测定DCF 荧光强度，以此代表细胞内ROS水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。计量资料采用Shaprio-Wilk 法进行正态性检验，呈正态分布的数据以表示，多组间比较采用方差分析，重复测量资料采用重复测量方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鸦胆子油乳对顺铂药物敏感性的影响观察结果 以0、2.44、9.77、78.12 µg/mL 鸦胆子油乳处理后的顺铂IC50分别为（1.98 ± 0.31）、（0.99 ±0.04）、（0.36 ± 0.02）、（0.10 ± 0.01）µg/mL，顺铂IC50随着鸦胆子油乳处理浓度的增高而下降（P均＜0.05）。

2.2 各组细胞形态及生长情况比较 对照组细胞生长较好，细胞数量较多且形状为正常生长状态；顺铂组及鸦胆子油乳组细胞数量较对照组均减少，可见少量碎片；鸦胆子油乳+顺铂组细胞生长受抑制较明显，细胞数量最少，细胞形状不规则且细胞碎片增多。见OSID码图1。

2.3 各组细胞周期比较 G0/G1期细胞比例鸦胆子油乳+顺铂组＞顺铂组、鸦胆子油乳组＞对照组（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞周期比较（）

表1 各组细胞周期比较（）

注：与对照组G0/G1期比较，*P＜0.05；与顺铂组G0/G1期比较，#P＜0.05。

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2.4 各组细胞凋亡率比较 对照组、鸦胆子油乳组、顺铂组、鸦胆子油乳+顺铂组细胞凋亡率分别为1.12% ± 0.27%、5.03% ± 0.65%、5.48% ±0.85%、10.15% ± 1.09%，细胞凋亡率鸦胆子油乳+顺铂组＞鸦胆子油乳组、顺铂组＞对照组（P均＜0.01）。

2.5 各组细胞内ROS 水平比较 对照组、鸦胆子油乳组、顺铂组、鸦胆子油乳+顺铂组DCF 荧光强度分别为11 012 ± 6 233、17 160 ± 8 087、14 306 ±7 380、19 758 ± 9 309，细胞内ROS 水平鸦胆子油乳+顺铂组＞鸦胆子油乳组、顺铂组＞对照组（P均＜0.05）。

3 讨论

我国为肺癌高发区，多数肺癌患者需要辅助化疗，但目前化疗药不良反应较多，且部分患者对治疗药物产生耐药，导致患者治疗效果不佳［6］。鸦胆子油乳是肺癌常用中成药，多项研究表明鸦胆子油乳可减少顺铂化疗的不良反应，同时可提高顺铂的临床疗效［7-8］。本研究在肺癌A549 细胞株中观察了鸦胆子油乳与顺铂的联合抗肿瘤效应。MTT 实验结果显示，鸦胆子油乳可呈浓度依赖性地降低顺铂的IC50，提示鸦胆子油乳在体外可以增强A549 细胞对顺铂的敏感度。鸦胆子油乳是以鸦胆子为原料提取的脂肪油，其有效成分主要为不饱和脂肪酸类成分［9］。有研究表明，不饱和脂肪酸能降低-SH 基含量，促使细胞膜变薄，从而增加抗癌药物向肿瘤细胞内渗入的机会，使细胞内化疗药物的浓度升高，从而产生更好的疗效［10］。这可能为鸦胆子油乳可增效顺铂抗肿瘤效应的解释之一，但其具体机制尚需进一步研究。

因为联合用药的目的在于降低单药使用的浓度，减少单药治疗对正常细胞的毒性作用，并且利用药物的协同作用增强其抗肿瘤活性，所以我们选择1/2 IC50左右的药物浓度联合用药进行后续研究。有研究显示，鸦胆子油乳能浓度依赖性地抑制A549 细胞G0/G1期比例，从而抑制肿瘤DNA 合成［11］。顺铂为细胞周期非特异性抗癌药物，本研究观察了鸦胆子油乳与顺铂单用或联用对肺癌A549细胞周期分布的影响，结果显示鸦胆子油乳或顺铂单用时均能导致A549 细胞G0/G1期细胞比例增加，而两药联用时G0/G1期细胞比例进一步增加。这提示鸦胆子油乳与顺铂单用均能导致细胞周期阻滞于G0/G1期，当两药联用时，这种阻滞效果更加明显。

多项研究表明，顺铂能够通过增加活性氧的产生促进肿瘤细胞的凋亡［12-13］。有研究发现，鸦胆子油乳及其单体成分去氢鸦胆子苦素B可浓度依赖性的抑制肺癌细胞A549的增殖，也可浓度依赖性地增加细胞内ROS 水平，从而诱导A549 细胞凋亡［11，14］。本研究结果显示，鸦胆子油乳或顺铂单用时均能使肺癌A549 细胞ROS 生成增加，细胞凋亡率升高；当两者联合应用时，细胞内ROS 水平更高，细胞凋亡率进一步增加，提示两药联合应用比单一用药诱导肿瘤细胞凋亡作用更加显著。

综上所述，鸦胆子油乳能够增加肺癌A549细胞对顺铂化疗的敏感性，其机制可能与阻滞肿瘤细胞于G0/G1期，增加活性氧的产生从而促进细胞凋亡有关，鸦胆子油乳可能作为一种潜在的化疗增敏剂应用于临床。本研究为体外细胞研究，而关于鸦胆子油乳是否能够在体内增加肺癌细胞对顺铂化疗的敏感性仍需要进一步的研究。