喀斯特地区不同海拔对油茶根际土壤丛枝菌根真菌物种群落的影响

曾维军 刘燕 秦维 罗文敏

摘要：本研究旨在了解喀斯特地区不同海拔油茶根际土壤丛枝菌根真菌（ａｒｂｕｓｃｕｌａｒ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ，ＡＭＦ）的种群多样性及物种分布特征，以提高ＡＭＦ 在喀斯特地区生态修复中的应用基础。 以贵州喀斯特高、低海拔地区油茶根际土壤为材料，利用Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ 测序平台进行高通量测序，分析ＡＭＦ 物种多样性及差异。 结果表明，喀斯特地区油茶根际土壤ＡＭＦ 中球囊霉属（Ｇｌｏｍｕｓ）占主要地位，整体丰度为８７.２８％；低海拔油茶根际土壤ＡＭＦ 群落特异ＯＴＵ 数和Ｓｈａｎｎｏｎ、Ｃｈａｏ１ 指数显著高于高海拔，物种多样性较为丰富，且组间ＡＭＦ 物种聚类较远；油茶根际土壤有机质和有效磷含量与球囊霉属真菌丰度呈显著正相关，相关系数分别为０.５８、０.６５，表明喀斯特的低磷土壤促进油茶根际球囊霉属的生长，增加土壤碳库，促进油茶对磷的吸收利用。其作用机理待进一步研究验证。

关键词：油茶；喀斯特地区；根际土壤；丛枝菌根真菌；多样性

中图分类号：Ｓ１５４.３文献标识号：Ａ文章编号：１００１－４９４２（２０２４）０１－０１０５－０８

贵州省６２％的国土面积为喀斯特地貌，总面积达１０.９１ 万ｋｍ２，居全国之首，是全球喀斯特发育最典型、最复杂、景观类型最丰富的地区之一[１] 。 喀斯特地貌地表干旱缺水，容易造成石漠化等生态退化问题[２] 。 通过植被恢复缓解石漠化是该地区生态修复的关键，但土壤的缺水和贫瘠导致植物难以定居、生长缓慢[３] 。 油茶是具有重要经济和生态价值的油料植物，贵州引种面积逐年增加，栽培过程中也面临着土壤保水保肥能力弱等问题，制约着油茶果产量和质量的提升。寻找一种提高油茶抗逆性的高效方法成为解决该问题的关键[４－５] 。

近年来研究发现，广泛定植于植物根部的丛枝菌根真菌（ＡＭＦ） 具有促进宿主营养吸收、抗病、抗旱和改善土壤微生态等功能[６－９] 。 世界上许多国家和地区也规定在特定环境下造林，必须采用菌根化的苗木，以增加移栽的存活率[１０－１１] 。刘燕等[１２] 前期研究也发现，耐旱且油茶果产量稳定的贵州野生油茶，其根系普遍被ＡＭＦ 定殖。 因此，对ＡＭＦ 的开发应用是未来研究的热点和趋势。

ＡＭＦ 的开发利用过程中存在两个主要问题，一是不同ＡＭＦ 对环境适应性存在差异，二是其高效培养和接种技术有待突破[１３－１４] 。 贵州喀斯特高、低海拔地區都有野生油茶林分布，不同海拔的油茶可能形成了自己特有的根际ＡＭＦ 群落。 本研究通过Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ 平台对喀斯特高、低海拔地区野生油茶根际土样进行高通量测序，探究ＡＭＦ 的物种多样性及其在土壤营养形成中的作用，为ＡＭＦ 在贵州喀斯特地区油茶绿色种植中的应用提供理论依据。

１ 材料与方法

１.１ 研究区概况

设置高海拔和低海拔２ 个研究区，海拔高度３００～２ ４２１ ｍ。 研究区属亚热带季风性和季风性湿润气候，年平均气温１１.５ ～ １９.２ ℃，年降水量９２６.２～１ ３４０.７ ｍｍ，年日照时数为１ ３２８ ～ １ ８１２ｈ，无霜期１８０～３４５ ｄ。 样区为野生油茶林，林龄为４０～５０ 年，经度在１０４.０８° Ｅ～１０９.０７° Ｅ，纬度在２４.９３° Ｎ～２７.４７° Ｎ。 每样地设３ 个野生油茶根际土壤采样点，样地详情见表１。

１.２ 土壤样品采集

２０２１ 年８ 月，在贵州省威宁、册亨、从江、玉屏县的野生油茶分布区内各设置规格为４００ ｍ２的３ 个相邻样方（２０ ｍ×２０ ｍ），在每个样方内沿“Ｓ”形路径分别选择１０ 株胸径和树高相近的油茶树，铲除落叶层并挖开上层覆土，剪下细根分枝并轻轻抖动，用毛刷将黏在细根上的土壤刷落到自封袋中。 每个样方内取１０ 份根际土壤，混匀后４ ℃冰箱保存，用于测定ＡＭＦ 多样性。 样品的采集与预处理参照?土壤微生物研究原理与方法?[１５] 。

１.３ 土壤样品测序

根据ｓｏｉｌ ＤＮＡ ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ－ｔｅｋ， Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，Ｕ.Ｓ.）使用说明进行总ＤＮＡ 提取。 １％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组ＤＮＡ 质量，使用Ｎａｎｏ￣Ｄｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公司，美国）测定ＤＮＡ浓度和纯度。 用两对特异性引物ＡＭＬ１/ ＡＭＬ２（５′ － ＡＴＣＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＡＧＧＡＴＡＧＡ － ３′；５′－ＧＡＡＣＣＣＡＡＡＣＡＣＴＴＴＧＧＴＴＴＣＣ－３′）和ＡＭＶ４－５ＮＦ/ＡＭＤＧＲ（５′－ＡＧＣＴＣＧＴＡＧＴＴＧＡＡＴＴＴＣＧ－３′；５′－ＣＣＣＡＡＣＴＡＴＣＣＣＴＡＴＴＡＡＴＣＡＴ － ３′） 进行巢式ＰＣＲ 扩增[１６] 。 ＰＣＲ 反应体系为： ５ × ＴｒａｎｓＳｔａｒｔＦａｓｔＰｆｕ 缓冲液４ mＬ，２.５ ｍｍｏｌ/ Ｌ ｄＮＴＰｓ ２ mＬ，上、下游引物（５ mｍｏｌ/ Ｌ）各０.８ mＬ，ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ ＦａｓｔＰｆｕＤＮＡ 聚合酶０.４ mＬ，ＤＮＡ 模板１０ mＬ，超纯水补足至２０ mＬ。 扩增程序如下：９５ ℃ 预变性３ ｍｉｎ；９５ ℃变性３０ ｓ，５５ ℃退火３０ ｓ， ７２ ℃延伸４５ ｓ，

２７ 个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ；４ ℃保存。 每样本３个重复。 将同一样本的ＰＣＲ 产物混合后使用２％琼脂糖凝胶回收，利用ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃ￣ｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｘｙｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）纯化，２％琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，并用Ｑｕａ￣ｎｔｕｓＴＭ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）对回收产物进行检测定量。 使用ＮＥＸＴＦＬＥＸ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ－ＳｅｑＫｉｔ 对纯化后的ＰＣＲ 产物进行建库。 委托上海美吉生物医药科技有限公司利用Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ 平台进行测序。

１.４ 土壤理化性质检测

土壤全氮、全磷、全钾、有效磷、速效钾含量及ｐＨ 值分别参照ＮＹ/ Ｔ ５３—１９８７、ＧＢ/ Ｔ ９８３７—１９８８、ＮＹ/ Ｔ ８７—１９８８、ＮＹ/ Ｔ １１２１.７—２０１４、ＮＹ/ Ｔ１８４９—２０１０、ＮＹ/ Ｔ － １２４１—１９９９ 中方法进行测定；碱解氮采用碱解扩散法测定[１７] 。

１.５ 数据统计与分析

使用Ｆｌａｓｈ１.２.１１ 进行ｐａｉｒ－ｅｎｄ 双端序列拼接；ＲＤＰ Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ２.１３ 进行序列分类注释；Ｕｓｅ￣ａｒｃｈ１１ 进行ＯＴＵ 统计；Ｍｏｔｈｕｒ１.３０.２ 进行Ａｌｐｈａ多样性分析，并对样本间的多样性指数进行ｔ 检验；Ｍｅｇａ７ 和ＩＱ－ＴＲＥＥ 进行进化树分析和构建；Ｒ语言（ｖｅｒｓｉｏｎ ３.３.１）进行物种Ｖｅｎｎ 图分析、制作群落柱形图以及ＮＭＤＳ 分析和作图。 最后使用Ａｄｏｂｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ２０２２ 修饰图形。 其中聚类方式采用ＵＳＥＡＲＣＨ７－ｕｐａｒｓｅ 算法，物种分类数据库为ｍａａｒｊａｍ０８１/ ＡＭＯＴＵ。

２ 结果与分析

２.１ 不同海拔野生油茶根际土壤ＡＭＦ 群落ＯＴＵ组成及结构

不同海拔野生油茶根际土壤中共获得３６７ １４８条高质量序列，样品平均序列为２０ ３９７条，总碱基数为７９ ３３８ ２１４ ｂｐ，平均序列长度为２１６ ｂｐ，序列相似度为０.９７，ＯＴＵ 分类置信度为０.７。由稀释曲线（图１）可知，抽取的序列条数达到１４ ２２３条以上，曲线趋于平坦，表明不同处理的土样样本测序数量足够，测序数据合理。 由Ｖｅｎｎ图（图２）可知，喀斯特高、低海拔地区ＡＭＦ 群落共有的ＯＴＵ 数为６１ 个，占总数的１８.３２％；高海拔地区特异ＯＴＵ 数为５７ 个，占总数的１７.１２％；低海拔地区特异ＯＴＵ 数为１５４ 个， 占总数的４６.２５％。

２.２ 不同海拔野生油茶根际土壤ＡＭＦ 群落结构及多样性

对喀斯特野生油茶根际土壤ＡＭＦ 群落进行物种注释得到１ 纲５ 目８ 科１４ 属７５ 种。 由图３可知，在属水平上，相对丰度排前４ 位的属分别为球囊霉属（Ｇｌｏｍｕｓ，８７.２８％）、无梗囊霉属（Ａｃａｕ￣ｌｏｓｐｏｒａ，５. ９７％）、盾巨孢囊霉属（ Ｓｃｕｔｅｌｌｏｓｐｏｒａ，２.７８％）、球囊菌纲中不能注釋的菌属（ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ＿ｃ＿Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ，２.１２％），球囊霉属为优势属。喀斯特高、低海拔地区相比，球囊霉属相对丰度差异不显著，无梗囊霉属和球囊菌纲中不能注释的菌属在高海拔地区相对丰度较高。 高海拔地区未发现盾巨孢囊霉属。不同海拔地区野生油茶根际土壤ＡＭＦ 群落α 多样性指数如表２ 所示，高海拔地区Ｓｈａｎｎｏｎ指数和Ｃｈａｏ１ 指数均显著低于低海拔地区，ＳＨＥＩ指数和ＰＤ 指数与低海拔地区相比差异不显著。表明喀斯特高海拔地区的野生油茶根际ＡＭＦ 群落的多样性和物种总数均显著低于低海拔地区。

２.３ 不同海拔野生油茶根际土壤ＡＭＦ 群落ＰＣｏＡ 分析与样本聚类分析

ＰＣｏＡ 分析可通过降维找出影响野生油茶根际土壤ＡＭＦ 样本群落组成差异的潜在主成分。由图４ 可知，在种水平上，主成分１（ＰＣ１）与主成分２（ＰＣ２）解释方差分别为５１.０５％和３２.５９％；在ＯＴＵ 水平上，主成分１（ＰＣ１）与主成分２（ＰＣ２）解释方差分别为２４.６０％和２２.８６％，影响野生油茶根际土壤ＡＭＦ 群落结构的主导因子明显（Ｐ <０.０５）。在种水平上，同一海拔、同一地点根际土壤３ 个重复比较聚集，不同地点之间分化明显，高海拔样点之间的物种分化较低海拔明显。 在ＯＴＵ水平上聚类情况与种水平上相反。

非度量多维尺度分析（ＮＭＤＳ）可将多维空间的研究对象简化到低维空间进行定位、分析和归类，揭示复杂背景下的简单规律。 由图５ 可知，在种水平上，高海拔野生油茶根际土壤样本组的ＡＭＦ 群落包含了低海拔土壤样本组，且Ｓｔｒｅｓｓ<０.０５，具有很好的代表性；在ＯＴＵ 水平上，不同海拔样本组间存在差异，且Ｓｔｒｅｓｓ<０.２。 ＰＣｏＡ 与ＮＭＤＳ 分析共同验证了贵州喀斯特高、低海拔间野生油茶根际土壤ＡＭＦ 群落组成差异明显，高海拔样本组涵盖了低海拔的ＡＭＦ 分子种。

基于ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｕｎｉｆｒａｃ 距离算法对贵州喀斯特高、低海拔野生油茶根际土壤样本进行层级聚类分析（图６）可知，高海拔地区Ａ３ 和Ａ６ 样本组的ＡＭＦ 种群相似，聚为一类。 高、低海拔的ＡＭＦ 物种组成丰度上有较大差异，说明海拔高低能改变ＡＭＦ 种群结构。 但是低海拔样本组Ｅ２ 与高海拔Ａ２ 组的ＡＭＦ 种群相似，聚为一类。威宁县草海镇（Ａ３）与从江县拱孑村（Ｄ２）两地海拔差为２ ０５２ ｍ，其ＡＭＦ 群落结构相似性最低。

２.４ ＡＭＦ 群落与土壤养分因子的相关性分析

通过方差膨胀因子分析（ＶＩＦ）对７ 个影响样本ＡＭＦ 菌群组成的土壤养分因子进行筛选，保留多重共线性较小的因子，进行后续研究。 由表３可知，筛选后的土壤养分因子分别为全磷、全钾、有效磷、速效钾和有机质，ＶＩＦ 值均小于１０。

通过计算筛选后的土壤养分因子与ＡＭＦ 物种之间的Ｐｅａｒｓｏｎ 相关系数，获得相关性热图（图７）。 结果表明，球囊霉属与土壤有机质和有效磷呈显著正相关，相关系数分别为０.５８、０.６５；多样孢囊霉属（Ｄｉｖｅｒｓｉｓｐｏｒａ） 和原囊霉属（Ａｒｃｈａｅｏｓｐｏ￣ｒａ）与全磷呈极显著正相关，相关系数分别为０.９１、０.９０；盾巨孢囊霉属与速效钾呈显著负相关，相关系数为－０.６１；无梗囊霉属（Ａｃａｕｌｏｓｐｏｒａ）与全钾呈极显著负相关，相关系数为－０.７８。

３ 讨论

除宿主特异性外，ＡＭＦ 的分布还受气候、土壤条件、纬度、空间隔离、干扰等多种非生物因子的影响[１８－２２] 。 研究发现，随着海拔的升高，青藏高原草甸ＡＭＦ 的物种丰度逐渐降低[２２] ；在宿主植物和土壤条件相似的情况下，ＡＭＦ 多样性随气温升高而增加[２３－２４] 。 本研究发现，低海拔地区油茶根际ＡＭＦ 群落特异ＯＴＵ 数、Ｓｈａｎｎｏｎ 指数、Ｃｈａｏ１ 指数显著高于高海拔地区，表明ＡＭＦ 物种总数和多样性随海拔的升高而降低；同时ＡＭＦ 的群落结构也发生了改变，与低海拔地区相比，高海拔地区油茶根际土壤中未发现盾巨孢囊霉属真菌。 本研究中，海拔高度的改变直接导致两地区间较大的年平均气温差，达７.７ ℃，说明野生油茶根际土壤ＡＭＦ 的物种结构和多样性差异也可能是由纬度、海拔差造成的环境温差导致。 另外，高、低海拔地区的油茶根际ＡＭＦ 物种可以通过聚类分析分别聚在一起，同时高、低海拔组间又有一定的物种隔离，说明在喀斯特地区海拔差异越大，油茶根际ＡＭＦ 物种的亲缘关系就越远。

石灰土是喀斯特地区分布最广的非地带性土壤，表现出高钙镁、低磷钾和土壤偏碱性的地球化学特征[２５] ，而在一定范围内，低磷土壤会促进ＡＭＦ 的生长[２６－２７] 。 研究表明，球囊霉属真菌能分泌球囊霉素，作为一种非专性蛋白，其主要作用是稳定和增加土壤有机碳库、改善土壤团聚体，还可以促进植物对磷的吸收，并能与铅结合在土壤重金属形态转化中具有潜在的重要意義[２８－３０] 。 本研究中，球囊霉属在ＡＭＦ 中占据主要地位，并与油茶根际土壤有机质和有效磷含量呈显著正相关，说明喀斯特的低磷土壤能提高油茶根际球囊霉属丰度，使土壤中的球囊霉素含量理论上得到提高，从而改善土壤质量，增加土壤碳库，促进油茶对磷的吸收。

４ 结论

贵州喀斯特高、低海拔地区的野生油茶根际土壤ＡＭＦ 多样性、群落结构、种水平上的聚类关系均具有显著差异，其中低海拔地区的ＡＭＦ 多样性较丰富，并与高海拔地区存在较为明显的种群亲缘隔离。 另外，喀斯特地区特有的石灰土中缺乏磷、钾，促进了油茶根际ＡＭＦ 的生长，尤其是球囊霉属，其分泌较多的球囊霉素扩撒到土壤中，可改善土壤质量、增加土壤碳库、促进油茶对磷的吸收利用，从而使油茶根际土壤有机质和有效磷含量增加。 其相关作用机理有待进一步研究验证。

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