中国沙棘ＨｒＮＨＸ６ 基因的生物信息学分析及其在盐胁迫下的表达模式

肖莎莎 费凡 董佳伟 张丹 马玉花

摘要：Ｎａ＋ / Ｈ＋逆向转运蛋白（ＮＨＸ）广泛存在于多种生物中，可调节植物响应盐胁迫。 本研究对中国沙棘ＨｒＮＨＸ６ 进行结构预测和分析，并采用ｑＲＴ－ＰＣＲ 技术分析不同浓度ＮａＣｌ 胁迫下ＨｒＮＨＸ６ 基因的表达情况。结果如下：①ＨｒＮＨＸ６ 基因总长为１ ３４７ ｂｐ，与月季花等植物ＮＨＸ６ 基因具有较高的同源性。 ②ＨｒＮＨＸ６ 为稳定的疏水性蛋白，定位于高尔基体膜中，不具有信号肽，含７ 个跨膜螺旋结构，且α－螺旋和无规则卷曲为其二级结构的主要构成元件，具有多个修饰位点。 ③盐胁迫下中国沙棘根、茎、叶中的ＨｒＮＨＸ６ 基因表达上调，说明ＨｒＮＨＸ６ 基因在中国沙棘响应盐胁迫的过程中可能发挥着重要的调控作用。 本研究结果可为阐明中国沙棘应对盐胁迫的机制奠定基础。

关键词：中国沙棘；盐胁迫；ＨｒＮＨＸ６ 基因；荧光定量ＰＣＲ；基因表达

中图分类号：Ｓ７９３.６；Ｑ７８６文献标识号：Ａ文章编号：１００１－４９４２（２０２４）０１－００１７－０７

土壤盐碱化是影响农业发展的全球性问题，由于工业污染、化肥过量使用和灌溉不合理等因素的影响，土壤盐碱化的程度不断上升[１] ，已成为影响植物生长的重要问题之一。 盐胁迫不仅会抑制植物种子的萌发，还会加速植物根系的木栓化[２] ，影响根系对水分和营养物质的摄入，从而抑制植物生长发育。

植物耐盐性可表现为Ｎａ＋ 被Ｎａ＋ / Ｈ＋ 逆向转运蛋白（ＮＨＸ）外排或区隔化以维持细胞内的低Ｎａ＋水平[３] 。 研究表明，在盐胁迫下，植物利用ＮＨＸｓ 将Ｎａ＋分离到液泡，可以促使细胞从外界应激环境中吸收水分以维持渗透平衡，调节细胞质中的Ｎａ＋浓度和ｐＨ，保护细胞器[４－５] 。 ＮＨＸ 基因已在许多植物中被鉴定出来，但不同植物其成员数量不同，例如，拟南芥中有８ 个ＮＨＸ 基因[６] ，葡萄中有６ 个ＮＨＸ 基因[７] ，棉花中有２５ 个ＮＨＸ 基因[８] 。 拟南芥的８ 个ＮＨＸ 蛋白中，ＡｔＮＨＸ１—Ａｔ￣ＮＨＸ４ 定位于液泡膜上，ＡｔＮＨＸ５ 和ＡｔＮＨＸ６ 定位于胞体内膜，ＡｔＮＨＸ７（ＡｔＳＯＳ１） 和ＡｔＮＨＸ８ 定位于质膜上；根据亚细胞定位，又可将它们分为液泡ＮＨＸｓ（ ｖａｃｕｏｌａｒ ＮＨＸｓ）、内膜ＮＨＸｓ （ ｅｎｄｏｓｏｍａｌＮＨＸｓ）、质膜ＮＨＸｓ（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ＮＨＸｓ）[６] 。ＡｔＮＨＸ１—ＡｔＮＨＸ４ 通过形成的跨膜质子梯度提供能量，介导Ｎａ＋区隔化，以减少过量盐离子对细胞的伤害，稳定细胞渗透压，使植物适应盐旱环境；ＡｔＮＨＸ５ 和ＡｔＮＨＸ６ 具体定位于跨高尔基体网络，可参与囊泡运输和细胞扩增活性，特别是在液泡运输中具有重要作用，并调节ｐＨ 和Ｋ＋；Ａｔ￣ＮＨＸ７ 通过盐超敏感（ｓａｌｔ ｏｖｅｒｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ＳＯＳ）信号传导途径赋予植物耐盐性，ＳＯＳ 途径包括ＳＯＳ１（质膜Ｎａ＋ / Ｈ＋ 反向运输蛋白）、ＳＯＳ２（丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶）和ＳＯＳ３（钙结合蛋白），其中ＳＯＳ２ 与ＳＯＳ３ 的复合物可调节ＳＯＳ１ 以去除细胞内的Ｎａ＋ [９－１０] ；ＡｔＮＨＸ８ 可以参与Ｌｉ＋ / Ｈ＋ 反向转运[１１－１２] 。 但目前有关ＮＨＸｓ 在中国沙棘应对盐胁迫时的作用机制研究报道相对较少。

中国沙棘（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ. ｓｉｎｅｎ￣ｓｉｓ）是一种胡颓子科（Ｅｌａｅａｇｎａｃｅａｅ）沙棘属（Ｈｉｐｐ￣ｏｐｈａｅ）植物，具有耐旱、抗寒、抗风沙等特性，在我国西北被广泛用于水土保持。 研究表明，在盐胁迫条件下，沙棘渗透压降低，体内脯氨酸、可溶性糖等渗透介质的含量增加，渗透调节能力增强，以使植株适应外界环境[１３] ；另一方面，沙棘体内抗氧化酶（ＰＯＤ、ＣＡＴ、ＳＯＤ 等）活性增强，可减轻活性氧对植株的伤害[１４] ，从而提高沙棘的耐盐性。本研究以中国沙棘的抗盐分子调节机制为切入点，对耐盐相关基因ＨｒＮＨＸ６ 及其编码蛋白进行结构分析和亚细胞定位预测，同时分析其在不同浓度ＮａＣｌ 胁迫下的表达模式，旨在为中国沙棘应对盐胁迫的机制阐明奠定基础，同时为高效耐盐基因的发掘提供依据。

１ 材料与方法

１.１ 试验材料

供试植物材料为长势一致的中国沙棘两年生扦插苗，由青海省西宁市大通县城关苗圃（３７°１４′４５″ Ｎ，１０１°３０′１５″ Ｅ，海拔２ ９２０ ｍ）提供。 ２０１９ 年７ 月２８ 日开始盐胁迫试验，将１８ 盆中国沙棘扦插苗随机分为６ 组，分别用５００ ｍＬ 浓度为０、２００、４００、６００、８００、１ ０００ ｍｍｏｌ/ Ｌ 的ＮａＣｌ 溶液浇灌， ３天后再浇灌一次。 每组处理的３ 盆作为３ 个重复，试验时在花盆底放置一个托盘，及时将漏出的溶液倒回花盆中，以防止水分和盐分的流失。 ８月２ 日采集根、茎、叶，用超纯水冲洗后用滤纸吸干水分，装入冻存管，置于液氮中速冻，随后放入－８０ ℃冰箱保存备用。

１.２ 试验方法

将中国沙棘根、茎和叶在液氮中研磨成细粉，依照植物ＲＮＡ 试剂盒说明书快速提取总ＲＮＡ，使用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ⅱ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ 反转录质量檢测合格的优质ＲＮＡ，并通过荧光定量ＰＣＲ 法分析表达模式，引物（ＨｒＮＨＸ６－Ｆ：ＣＡＡＴＧＧＡＴＡＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＣＧＴ， ＨｒＮＨＸ６ － Ｒ：ＣＴＡＡＴＧＣＴＧＴＡＡＡＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴ）由宝生物工程（大连）有限公司合成。 使用２－ΔΔＣｔ法对基因的相对表达量进行分析，使用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０和ＳＰＳＳ ２２ 软件进行数据整理与统计分析。

ＨｒＮＨＸ６ 基因的全长序列通过转录组测序获得。 用ＤＮＡＳＴＡＲ 进行核苷酸序列分析和同源比对；用ＭＥＭＥ 进行保守基序分析；用ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔ￣Ｐａｒａｍ 进行蛋白理化性质分析；用ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ进行亚细胞定位；用ＮｅｔＯＧｌｙｃ ４.０ Ｓｅｒｖｅｒ 进行信号肽和跨膜螺旋区分析；Ｉ－ＴＡＳＳＥＲ 用于预测蛋白二级结构，ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ 用于预测三级结构；ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ 用于蛋白功能位点的预测。

２ 结果与分析

２.１ ＨｒＮＨＸ６ 基因序列分析

２.１.１ ＨｒＮＨＸ６ 基因的核苷酸序列分析 ＨｒＮ￣ＨＸ６ 基因序列长度为１ ３４７ ｂｐ，含３４３ 个Ａ、２８８个Ｇ、４７０ 个Ｔ、２４６ 个Ｃ，Ａ＋Ｔ 的含量（６０.３６％）高于Ｇ＋Ｃ 的含量（３９.６４％）。

２.１.２ ＨｒＮＨＸ６ 蛋白的氨基酸序列分析 ＨｒＮ￣ＨＸ６ 基因编码４４８ 个氨基酸，其中，酸性氨基酸（Ｄ、Ｅ）３６ 个，碱性氨基酸（Ｋ、Ｒ）２２ 个，极性氨基酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）１１９ 个，疏水性氨基酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）１９０ 个，分别占氨基酸总量的８.０％、５.０％、２６.６％、４２.４％。 在该蛋白中Ｌｅｕ （Ｌ）和Ｓｅｒ（Ｓ）含量较高，所占比例分别为１２.３％和９.８％。

２.１.３ ＨｒＮＨＸ６ 基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分析 将ＨｒＮＨＸ６ 与１０ 种植物ＮＨＸ６ 基因的核苷酸和氨基酸序列进行同源比对分析，结果（图１、图２）表明，ＨｒＮＨＸ６ 与其他植物ＮＨＸ６ 基因核苷酸序列的同源性为８２.９％～８５.７％，氨基酸序列的同源性则达到８４.９％～８９.７％，其中中国沙棘与月季花的序列同源性最高。

２.１.４ ＨｒＮＨＸ６ 基因保守基序分析 通过ＭＥＭＥ软件对ＨｒＮＨＸ６ 的保守基序进行分析，共得到１５个保守结构域，每个结构域的长度为５０ 个保守氨基酸，具有１１ 个位点，且Ｅ 值都显著。 ＨｒＮＨＸ６保守基序与橡胶树、山谷白栎、欧洲野苹果等植物ＮＨＸ６ 基因保守基序完全一致（图３）。

２.２ ＨｒＮＨＸ６ 蛋白结构预测

２.２.１ ＨｒＮＨＸ６ 蛋白理化性质及亚细胞定位 ＨｒＮＨＸ６ 蛋白分子式为Ｃ２２６０ Ｈ３４３６ Ｎ５５２ Ｏ６３６ Ｓ２０，分子量为４９ １５６.８４ Ｄａ，理论等电点为５.４７５，脂肪系２.２.２ 信号肽预测 ＮｅｔＯＧｌｙｃ ４.０ Ｓｅｒｖｅｒ 分析表明，切割位点Ｃ 的最大值为０.２４３，位于第３３ 位氨基酸；信号肽分数Ｓ 的最大值为０.１７９，位于第４４位氨基酸；合并切割位点Ｙ 的最大值为０.１６４，位于第３３ 位氨基酸（图５）。 Ｓ 的平均值为０.１１７，预测剪切点在１～２８ 位氨基酸。 Ｓ 的平均值远低于０.５，表明ＨｒＮＨＸ６ 蛋白是一种没有潜在信号肽位点的非分泌蛋白。

２.２.３ ＨｒＮＨＸ６ 蛋白结构及功能位点预测 ＨｒＮ￣ＨＸ６ 蛋白二级结构中α－螺旋、无规则卷曲、延伸链、β － 折叠分别占４９. ３３％、３３. ２６％、１３. ６２％、３.７９％，α－螺旋和无规则卷曲是其主要构成成分（图６）。 蛋白三维构象如图７ 所示。 跨膜区预测结果（图８）显示，ＨｒＮＨＸ６ 含７ 个跨膜螺旋结构，属于跨膜蛋白。

ＨｒＮＨＸ６ 蛋白功能位点的预测结果显示该蛋白包含多个修饰位点：２ 个Ｎ－糖基化位点，即始于２１５ 位氨基酸的ＮＬＳＥ 和始于３７５ 位的ＮＥＳＦ；２ 个蛋白激酶Ｃ 磷酸化位点，分别为始于２２ 位的ＳＰＫ 和始于２２０ 位的ＳＱＲ；５ 个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，分别为始于７７ 位的ＳＡＴＤ，始于２３３ 位的ＳＬＡＥ，始于３１７ 位的ＳＩＨＤ，始于３５０ 位的ＴＭ￣ＬＥ，始于４１４ 位的ＴＡＬＤ；９ 个Ｎ－豆寇酰基化位点，分别为始于３１ 位的ＧＡＩＶＴＦ，始于４０ 位的ＧＴＦＩＡＳ，始于７３ 位的ＧＳＬＩＳＡ，始于９２ 位的ＧＳＤ￣ＶＮＬ，始于１４５ 位的ＧＳＬＳＡＧ，始于１５２ 位的ＧＶＧ￣ＦＴＳ，始于１９２ 位的ＧＬＧＬＳＧ，始于３０４ 位的ＧＬＲ￣ＧＡＭ，始于３４５ 位的ＧＧＳＴＧＴ。

２.３ 不同浓度ＮａＣｌ 胁迫下ＨｒＮＨＸ６ 基因的表达模式分析

ＮａＣｌ 胁迫下，中国沙棘根、茎、叶中的ＨｒＮＨＸ６基因均上调表达（图９）。 在中国沙棘叶中，其表达量随着ＮａＣｌ 浓度的增加逐渐升高，当ＮａＣｌ 浓度超过６００ ｍｍｏ/ Ｌ 后，表达量显著升高；在茎中，其表达量呈现先升高后降低的趋势，在４００ ｍｍｏｌ/ Ｌ ＮａＣｌ 处理下最高，ＮａＣｌ 浓度继续升高，其表达量略有下降且变化趋于平缓，但均显著高于０～２００ ｍｍｏｌ/ Ｌ ＮａＣｌ处理；在根中，其表达量则表现为波动上升趋势，在１ ０００ ｍｍｏｌ/ Ｌ ＮａＣｌ 处理下达到最高，除与６００ｍｍｏｌ/ Ｌ ＮａＣｌ 处理差异不显著外，显著高于其他处理。

３ 讨论与结论

本研究结果表明，中国沙棘ＨｒＮＨＸ６ 基因序列全长为１ ３４７ ｂｐ，有１５ 个保守结构域；ＨｒＮＨＸ６为稳定蛋白，定位于高尔基体膜中，这与拟南芥中ＡｔＮＨＸ６ 定位于胞体如高尔基体内膜[１５] 的结论一致。 高尔基体网络被认为是细胞成分运输的中心，连接到内质网、液泡和质膜[１６] 。 在盐胁迫下，植物产生大量的次生代谢物并分离破坏细胞结构的盐离子，这都取决于高尔基体网络的作用。 因此推测ＨｒＮＨＸ６ 的耐盐作用机制可能依赖于高尔基体网络的功能。 ＨｒＮＨＸ６ 蛋白的疏水性较强，具有多个疏水区，且含有７ 个跨膜结构域。 此外，ＨｒＮＨＸ６ 蛋白為非分泌蛋白，没有潜在的信号肽位点，这与杨平等[１７] 的研究结果一致，符合植物ＮＨＸ 的基本特征。

ＨｒＮＨＸ６ 蛋白二级结构的主要构成元件为α－螺旋与无规则卷曲，分别占４９.３３％和３３.２６％。α－螺旋靠链内氢键维持，两侧分别由疏水性和亲水性氨基酸组成。 疏水侧通过疏水键与磷脂双分子层相互作用将蛋白固定在膜上使得ＨｒＮＨＸ６ 蛋白具有稳定跨膜结构域，亲水侧则形成空桶状结构使得ＨｒＮＨＸ６ 蛋白可进行水分跨膜运输。 这些结构特征赋予了ＨｒＮＨＸ６ 蛋白高效转运水分的功能，与该蛋白具有７ 个跨膜螺旋结构的分析结果一致。 此外，功能位点预测表明，中国沙棘ＨｒＮ￣ＨＸ６ 具有２ 个Ｎ－糖基化位点、２ 个蛋白激酶Ｃ 磷酸化位点、５ 个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、９ 个Ｎ－豆寇酰基化位点，说明ＨｒＮＨＸ６ 蛋白可通过糖基化、磷酸化、豆蔻酰化等修饰调节该蛋白的功能和构造进而完成Ｎａ＋的转运。

植物ＮＨＸ 在耐盐、调节ｐＨ、保持Ｋ＋ 稳态以及细胞扩张、细胞囊泡的转运等方面发挥着关键作用，可增强石榴[１８] 、玉米[１９] 、桃[２０] 等的耐盐性。盐胁迫下，苜蓿ＭｔＮＨＸ６ 基因在不同组织中的表达水平不同，且在叶片和根部的表达量较高[２１] ；玉米ＺｍＮＨＸ６ 基因在根中显著表达[１９] ；而在拟南芥幼苗中几乎检测不到ＡｔＮＨＸ６ 基因的表达[２２] 。 这些结果表明不同植物的ＮＨＸ６ 基因在盐胁迫下行使功能的主要组织部位不同。 本研究结果表明，ＮａＣｌ 胁迫下ＨｒＮＨＸ６ 基因在中国沙棘根、茎、叶中均上调表达，这与在石榴[１８] 和拟南芥[２３] 等植物中的研究结果一致；但不同ＮａＣｌ 浓度下其表达量差异较大，且同一胁迫浓度下其在不同组织中的表达也不同。 此外，中国沙棘ＨｒＮ￣ＨＸ６ 基因受盐胁迫显著诱导，表明中国沙棘ＨｒＮ￣ＨＸ６ 基因在盐胁迫中行使重要的生物学功能。Ｓａｎｄｈｕ 等[２１] 研究发现，盐胁迫下ＭｔＮＨＸ６ 基因在苜蓿根部上调表达的幅度显著高于其他组织。 本研究亦得到相似结果，这可能是由于根组织最先接触到盐胁迫的缘故。 另外，根中ＨｒＮＨＸ６ 基因表达显著上升有助于根中細胞的Ｎａ＋ 外排或区隔化，以维持细胞内低Ｎａ＋水平，从而减轻盐胁迫对植物地上部分的伤害，同时通过渗透调节促进根系吸水。

本研究结果可为中国沙棘ＨｒＮＨＸ６ 基因功能研究提供一定的理论参考，并为中国沙棘耐盐育种基因的挖掘奠定基础。

参 考 文 献：

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[２２] Ｙｏｋｏｉ Ｓ， Ｑｕｉｎｔｅｒｏ Ｆ Ｊ， Ｃｕｂｅｒｏ Ｂ， ｅｔ ａｌ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＮＨＸ Ｎａ＋ / Ｈ＋ ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒｓｉｎ ｔｈｅ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ[Ｊ]. Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２００２， ３０（５）： ５２９－５３９.

[２３] Ｗａｎｇ Ｌ Ｇ， Ｗｕ Ｘ Ｘ， Ｌｉｕ Ｙ Ｆ， ｅｔ ａｌ. ＡｔＮＨＸ５ ａｎｄ ＡｔＮＨＸ６ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｋ＋ ａｎｄ ｐＨ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ： ｔｈｒｅｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｃｉｄｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｋ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ[ Ｊ].ＰＬｏＳ ＯＮＥ， ２０１５， １０（１２）： ｅ０１４４７１６.