小麦类病斑突变体ｌｍｐａ１ 的早衰特性研究

夏丹阳 徐超 文晓阳 康国章 王黎明

摘要：本研究以小麦品系ＫＤ５２７ 及其经ＥＭＳ 诱变创制出的类病斑型早衰突变体ｌｍｐａ１ 和两者的杂交Ｆ１、Ｆ２ 群体为材料，分析其类病斑发生动态、农艺及产量性状，并进行相关光合指标测定与组织化学染色鉴定，以期分析ｌｍｐａ１ 发生类病斑早衰的生理生化机制。 结果表明，ＫＤ５２７ 能正常完成生长成熟过程，而ｌｍｐａ１在生长前期表现正常，挑旗后叶片受光诱导而发生类病斑反应，出现黄褐色类病斑，且随生育期延长，类病斑逐渐蔓延至叶鞘、茎秆和穗部，引发整株早衰直至干枯死亡，導致其产量降低；类病斑发生期间，ｌｍｐａ１ 叶片净光合速率、气孔导度和蒸腾速率显著低于ＫＤ５２７（Ｐ<０.０１），胞间ＣＯ２ 浓度显著高于ＫＤ５２７（Ｐ<０.０１）；总叶绿素量含量明显低于ＫＤ５２７，且二者之间的差异随类病斑发生程度的增加而增大；类病斑发生初期，ｌｍｐａ１ 的叶片过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）含量及过氧化氢酶（ＣＡＴ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化物酶（ＰＯＤ）活性均较ＫＤ５２７高，随着类病斑扩散，其ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＰＯＤ 活性急剧下降，Ｈ２Ｏ２ 含量急剧增加；组织化学染色分析表明类病斑发生部位出现细胞死亡。 本结论为类病斑早衰基因Ｌｍｐａ１ 调控小麦早衰发生的生理生化机制研究奠定了理论基础。

关键词：小麦；类病斑型早衰；突变体ｌｍｐａ１；生理生化；光诱导

中图分类号：Ｓ５１２.０１文献标识号：Ａ文章编号：１００１－４９４２（２０２４）０１－００５８－０８

衰老是作物器官发育的最后一个进程，这个时期叶片中积累的碳水化合物和矿物质向植物其他生长相对旺盛的部位分解运输。 植物衰老受内部基因调控和外部环境因素等的影响，在发育生物学上具有非常重要的意义[１] 。 早衰是指作物的生理生化过程提早结束，导致作物有效生长发育时间缩短，是造成作物产量和品质下降的重要原因[２－４] 。 对小麦而言，衰老过程伴随其灌浆期，小麦籽粒产量的７０％来自于开花后光合器官所生产的干物质，过早衰老会限制其灌浆质量，影响小麦产量，是制约小麦高产稳产的重要因素[４] 。目前关于植物早衰的假说有基因调控假说、激素失衡假说、自由基损失学说和糖诱导假说等[５－６] ，但对于植物早衰机制的研究仍不够全面和深入。因此，发掘小麦早衰突变体并对其开展生物学特性研究，对于深入了解小麦早衰的发生机制和选育高产、稳产新品种具有非常重要的意义。

植物类病斑突变体能够在无病原体侵染的情况下自发产生类似病变的坏死性斑点，且病斑会逐步扩散至叶鞘、茎秆甚至整株，影响籽粒灌浆质量，最终影响产量和品质[７－８] 。 目前在拟南芥[９] 、水稻[１０] 、谷子[１１] 、小麦[１２] 等作物中均有报道，其中水稻相关方面的研究最为深入。 小麦类病斑突变体的研究起步较晚，目前，主要涉及类病斑突变体的基因定位和遗传调控等方面，尚未有基因克隆的相关报道。 Ｌｉ 等[１３] 将源于自然突变体Ｎｉｎｇ７８４０ 的类病斑基因ｌｍ 定位到２ＢＬ 染色体上；２０１６ 年，Ｗａｎｇ 等[１４] 将自然突变体ｌｍ３ 的类病斑基因定位在３ＢＬ 染色体上，杨佳秀等[１５] 将类病斑突变基因Ｌｍ３ 定位在３ＢＬ 染色体上；随后，ｌｍ４[１６] 、Ｌｍ５[１７] 也通过ＢＳＲ－ｓｅｑ 等方法被精细定位；Ｚｈａｎｇ 等[１８] 将来自亲本Ｎ０７２１６ 的类病斑显性基因ＴａＳｐｌ１ 定位于３ＤＳ 染色体上，并发现该基因同时受ＴａＳｐｌ１－ｉ１ 和ＴａＳｐｌ１－ｉ２ 显性基因抑制。类病斑早衰突变体是一类特殊的类病斑突变体，在自发形成坏死性病斑的同时又伴有植株早衰现象，而在众多类病斑突变体中发生早衰现象的仅占极少数[１９] 。 Ｋｏｎｇ 等[２０] 在小麦突变体库中鉴定了首个类病斑型早衰突变体ｌｍｐａ１，并将其早衰基因初步定位在５ＡＬ 染色体上。 但关于该突变体引起小麦早衰发生的相关生理生化机制尚未见报道，为此本研究对该突变体的衰老发生及不同衰老程度的生物学特性进行观察和分析，以期解析小麦类病斑型早衰的生理生化机制。

１ 材料与方法

１.１ 试验材料与概况

本试验以小麦新品系ＫＤ５２７、类病斑早衰突变体ｌｍｐａ１（从ＫＤ５２７ 的ＥＭＳ 突变体库中筛选获得的稳定遗传的早衰突变体）及二者的杂交Ｆ１、Ｆ２ 群体为材料。 所有供试材料均由河南科技大学小麦种质创新组提供，于２０２１ 年１０ 月２９ 日种植于河南科技大学开元校区农场试验田。 行长１.２ ｍ，行宽０.２５ ｍ，株距１０ ｃｍ。 水肥管理同大田其他材料。

１.２ 试验设计

２０２２ 年４ 月６ 日，在类病斑发生初期，随机选取突变体ｌｍｐａ１ 植株上尚未出现斑点的旗叶，用锡箔纸包住叶片的一部分（约３ ｃｍ）进行黑暗遮光处理；待叶片其他部位均出现类病斑后，取下锡箔纸恢复光照，观察记录叶片遮光处理及恢复光照后该部位的类病斑发生情况。 重复３ 次。

１.３ 测定项目及方法

１.３.１ 农艺及产量性状测定 灌浆后期，分别随机选取突变体ｌｍｐａ１、ＫＤ５２７ 及其杂交Ｆ１、Ｆ２ 分离群体各２０ 株，调查株高、穗粒数、千粒重、穗长、单株产量、旗叶长等性状。

１.３.２ 叶绿素含量测定 在ｌｍｐａ１ 类病斑发生前１ ｄ 及发病５、１０、１５、２０、２５ ｄ 共６ 个时期，分别随机选取３ 株ｌｍｐａ１、ＫＤ５２７ 的旗叶采样，剪碎研磨后称取０.１ ｇ，丙酮浸泡后暗处理２４ ｈ，使用分光光度法测定叶绿素含量（ＳＰＡＤ）[２１] 。

１.３.３ 光合参数测定 在ｌｍｐａ１ 发病１５ ｄ 时，随机选取长势一致的ＫＤ５２７ 与ｌｍｐａ１ 单株，用便携式光合仪ＬＩ－６４００ＸＴ 测定旗叶净光合速率（Ｐｎ）、气孔导度（Ｇｓ）、蒸腾速率（Ｔｒ）和胞间ＣＯ２ 浓度（Ｃｉ）。

１.３.４ Ｈ２Ｏ２ 含量及相关酶活性测定 分别剪取ｌｍｐａ１ 发病１、６、１２、１８、２４ ｄ 的旗叶，以ＫＤ５２７ 为对照，参考Ｙｉｎ 等[２４] 的方法，分别进行Ｈ２Ｏ２ 含量和过氧化氢酶（ＣＡＴ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化物酶（ＰＯＤ）活性测定。 相关试剂盒采用北京索莱宝科技有限公司产品，所有操作均按试剂盒说明书进行。

１.３.５ 组织化学染色 取ｌｍｐａ１ 发病１５ ｄ 和同时期ＫＤ５２７ 的旗叶，参考Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ 等[２２] 的方法使用二氨基联苯胺（ＤＡＢ）染色法检测叶片中过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）积累量。 试剂盒来自北京索莱宝科技有限公司，观察叶片是否出现红褐色斑点并拍照记录。 参照Ｋｏｎｇ 等[２３] 的方法，使用伊文思蓝（Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ， ＥＢ）染色法观察叶片上细胞死亡情况并拍照记录。

１.４ 数据处理与分析

试验数据用ＳＰＳＳ ２５.０ 软件进行处理、统计分析和显著性检验。

２ 结果与分析

２.１ ｌｍｐａ１ 类病斑早衰发生动态观察

对ＫＤ５２７ 和突变体ｌｍｐａ１ 进行全生育期生长发育动态观察发现，ＫＤ５２７ 全生育期未出现早衰现象。 由图１ 可以看出，突变体ｌｍｐａ１ 在苗期表现正常；挑旗后整株叶片开始随机出现黄褐色类病斑，随着生育期延长，斑点扩大、数量增多，但是斑点在叶片上出现的位置、大小及强度是随机的；抽穗后类病斑迅速蔓延到所有叶片，甚至叶鞘、茎秆、穗部的颖壳及麦芒，直至灌浆中后期，突变体ｌｍｐａ１ 整株严重干枯至死亡。 表明突变体在挑旗前后开始出现早衰现象，灌浆中后期完全枯死。

２.２ ＫＤ５２７、ｌｍｐａ１ 及其Ｆ１、Ｆ２ 群体的农艺及产量性状分析

从表１ 中看出，ｌｍｐａ１ 与ＫＤ５２７ 的穗长、旗叶长无显著差异；ＫＤ５２７ 的穗粒数、千粒重、单株产量分别为６１.８ 粒和４９.３１、２７.３６ ｇ，ｌｍｐａ１ 的分别为５５.９ 粒和３９.９１、２２.６２ ｇ，三者较ＫＤ５２７ 分别显著下降９.５％、１９.１％、１７.３％。 表明，ｌｍｐａ１ 类病斑发生导致ｌｍｐａ１ 植株在灌浆末期干枯死亡，生育期缩短，直接影响其籽粒发育和灌浆质量。

在对ＫＤ５２７、ｌｍｐａ１ 进行农艺学鉴定基础上，对其杂交Ｆ１、Ｆ２ 群体的农艺性状进行鉴定（表１）。 发现Ｆ１ 群体单株全部出现类病斑而发生早衰，千粒重、单株产量较ＫＤ５２７ 分别显著降低１７.３％、１４.４％；Ｆ２ 分离群体中，有早衰和正常两种表型，其中早衰植株的穗长、旗叶长与正常植株相比无显著差异，穗长与ＫＤ５２７ 相比也无显著差异，但其余性状显著降低，其中千粒重、单株产量分别为４０.３５、２２.８５ ｇ，较正常植株和ＫＤ５２７ 分别显著下降１８.６％、１４.８％和１８.２％、１６.５％。 说明突变体ｌｍｐａ１ 的早衰特性在后代群体中具有很强的遗传效应。

２.３ ｌｍｐａ１ 对光照的响应

于孕穗期对ｌｍｐａ１ 尚未发生类病斑的叶片进行１２ ｄ 的锡箔纸遮光处理，取下锡箔纸后发现遮光部位没有类病斑出现（图２ａ），而自然光照下的叶片其他部位逐渐出现褐色斑点；遮光结束取下锡箔纸恢复光照７ ｄ 后，原遮光部位也出現了斑点（图２ｂ）。 这表明突变体ｌｍｐａ１ 类病斑的产生可能与光诱导有关。

２.４ ｌｍｐａ１ 叶片叶绿素含量分析

对ｌｍｐａ１、ＫＤ５２７ 挑旗后的旗叶进行叶绿素含量测定，结果（图３）表明，在类病斑发生前ｌｍｐａ１叶片中叶绿素ａ、ｂ及总叶绿素含量与ＫＤ５２７均无明显差异；类病斑发生后，随着类病斑扩散程度的加剧，突变体叶片中叶绿素含量下降明显，类病斑发生１０ ｄ 后突变体叶片中叶绿素含量比ＫＤ５２７ 明显增加。 表明类病斑的发生导致突变体ｌｍｐａ１ 叶片逐渐失绿，光合色素含量呈下降趋势。

２.５ ｌｍｐａ１ 叶片光合参数分析

由表２ 可知，ＫＤ５２７ 叶片的Ｐｎ、Ｇｓ、Ｔｒ 均显著高于突变体ｌｍｐａ１（Ｐ<０.０１），Ｃｉ 显著低于ｌｍｐａ１（Ｐ<０.０１）。 说明ｌｍｐａ１ 的光合能力显著低于ＫＤ５２７。 类病斑早衰突变体的植株衰老提前，扰乱了光合生理过程，影响植株光合能力，进而影响其产量。

２.６ ｌｍｐａ１ 叶片衰老相关参数分析

ｌｍｐａ１ 类病斑发生后，对ｌｍｐａ１、ＫＤ５２７ 叶片抗氧化酶ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＰＯＤ 活性和Ｈ２Ｏ２ 含量的测定结果（图４）发现：类病斑刚出现时（１ ｄ），ｌｍｐａ１叶片酶活性和Ｈ２Ｏ２ 含量与ＫＤ５２７ 无明显差异；类病斑发生６～１２ ｄ 内，ｌｍｐａ１ 叶片Ｈ２Ｏ２ 含量和ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＰＯＤ 活性均高于ＫＤ５２７，表明发病初期，ｌｍｐａ１ 叶片活性氧含量增加的同时，体内清除自由基的能力增强；随着病程延长与类病斑扩散程度加深，ｌｍｐａ１ 叶片ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＰＯＤ 活性均明显低于ＫＤ５２７，至发病２４ ｄ 时，分别较ＫＤ５２７ 降低３４.４９％、３５.７１％、４９.５９％，而叶片Ｈ２Ｏ２ 含量则逐渐升高，且明显高于ＫＤ５２７，至发病２４ ｄ 时较ＫＤ５２７ 高６８.６２％。 说明突变体ｌｍｐａ１ 叶片活性氧清除系统严重受损，清除自由基的能力下降。Ｈ２Ｏ２ 的过度积累可能导致细胞死亡。

２.７ ｌｍｐａ１ 叶片组织化学染色鉴定

对ｌｍｐａ１ 发病１５ ｄ 的叶片与同时期ＫＤ５２７相同部位的叶片分别进行ＤＡＢ、ＥＢ 染色鉴定，结果（图５）表明，ＫＤ５２７ 叶片未染上颜色；ｌｍｐａ１ 叶片的类病斑发生部位染色较深，表明叶片类病斑发生部位周围积累了大量的Ｈ２Ｏ２，而活性氧大量积累是细胞死亡的一个重要标志，这就说明ｌｍ￣ｐａ１ 叶片已经发生了小面积的细胞坏死。

３ 讨论

本研究结果表明，类病斑突变体ｌｍｐａ１ 的病斑在挑旗期出现，并随着生育期延长逐渐变大，甚至遍布整株，与他人关于突变体发病时期、部位及斑点颜色的报道存在不同。 如突变体ｌｍｐａ１ 与ＬＦ２０１０ 的病斑都为黄褐色，但ＬＦ２０１０ 的病斑发生在三叶期，且为普通斑点不存在坏死症状[２５] ；类病斑基因ｌｍ４[１６] 所控制的突变体与ＨＬＰ[２６] 的病斑发生时间一致，但ＨＬＰ 与Ｉ３０[２７] 、ｗｓｌ[２８] 的病斑都为白色，与突变体ｌｍｐａ１ 病斑的颜色不同；Ｎｉｎｇ７８４０[１３] 的病斑颜色、发病时期与ｌｍｐａ１ 相近，但其发病范围只在叶片，且病斑产生为氮依赖型。 这表明ｌｍｐａ１ 是与已报道的类病斑突变体不同的新型类病斑型早衰突变体材料。 水稻上突变体ｓｐｌ２８[２９] 、ＯｓＬＭＳ[３０] 等都出现叶片早衰现象，但在ｌｍｐａ１ 之前小麦上尚未报道过导致早衰的类病斑突变体。

突变体ｌｍｐａ１ 与其野生型ＫＤ５２７ 相比，株高、穗粒数、千粒重和单株产量均显著降低，但穗长、旗叶长无显著差异，原因可能是ｌｍｐａ１ 的类病斑突变发生较晚，且前期主要发生在下部叶，当斑点蔓延到上部叶及茎秆时植株的农艺性状已基本发育完成，但灌浆期植株开始干枯，光合作用及籽粒灌浆受阻，表现为籽粒干瘪，籽粒品质和产量受影响显著。 Ｋｏｎｇ 等[２０] 的研究中将控制ｌｍｐａ１ 早衰的Ｌｍｐａ１ 基因定位到小麦的５ＡＬ 染色体上，这为探究小麦衰老过程及及其光合代谢等生理生化特性提供了良好的种质基础，也为小麦早衰引起产量与品质降低等方面的研究提供了参考。

研究发现，强光条件下，植物叶片表面气孔关闭，发生光呼吸，叶绿体中ＣＯ２ 含量减少，Ｏ２ 含量增加，叶绿体的氧化活性增强，导致叶绿体中产生大量活性氧，引起生物膜脂过氧化，从而加速植物衰老[３１－３３] 。 这表明光照在调节光呼吸和氧化还原的稳态中起着重要作用。 有研究表明，类病斑突变体ｌｍ５[１７] 、ｌｍｍ４[３４] 、ｓｐｌ３４[３５] 等的病斑产生受光诱导。 本研究中ｌｍｐａ１ 类病斑的形成也与光诱导有关，且类病斑周围出现过氧化氢积累和细胞死亡，这与前人研究[３６－３８] 的结果一致。 表明正常光照引发了ｌｍｐａ１ 植株内的氧化还原稳态失衡，过氧化氢大量积累导致细胞死亡，从而形成坏死性斑点。

对ｌｍｐａ１ 不同发病时期的生理生化指标的测定结果表明，在发病初期，突变体ｌｍｐａ１ 中活性氧清除机制未受到损伤，虽然体内活性氧含量增加，但ＣＡＴ、ＰＯＤ、ＳＯＤ 活性也均提高；随着类病斑扩散及早衰进程推进，活性氧含量逐渐增加，而抗氧化酶活性大幅降低，可能是活性氧积累量超出防御机制的调控范围，活性氧清除系统遭到破坏，过量的Ｈ２Ｏ２ 积累使膜脂过氧化，细胞膜被破坏，导致细胞死亡。 此外由于类病斑的面积不断扩散，突变体ｌｍｐａ１ 因叶肉细胞减少而表现为绿色程度降低，光合色素含量降低，光合面积不断减少，光合性能全面下降，导致籽粒干瘪、产量降低、品质变劣。 本研究对ｌｍｐａ１ 早衰特性的生物学研究，可为类病斑早衰基因Ｌｍｐａ１ 调控类病斑早衰发生的生理生化机制解析奠定基础。

另外，在本研究的基础上，我们也在尝试利用ＲＮＡ－Ｓｅｑ 与ＫＡＳＰ 等技术筛选与类病斑早衰基因Ｌｍｐａ１ 紧密连锁的ＳＮＰ 标记，完成其精细定位，筛选并克隆早衰相关的可能候选基因，验证其功能，并利用ＲＮＡ－Ｓｅｑ 技术进行不同时期的转录组测序分析，以期揭示Ｌｍｐａ１ 调控小麦早衰的分子机制。

４ 结论

突变体ｌｍｐａ１ 是一个具有类病斑表型并致使小麦衰老嚴重提前、籽粒产量和品质降低的特殊突变体。 本研究结果表明，突变体ｌｍｐａ１ 类病斑发生受光照诱导，在挑旗期自发产生黄褐色斑点，随生育进程推进斑点扩散至整株，导致光合色素减少，光合效率降低，同化能力减弱，严重影响籽粒灌浆；同时，植株体内清除活性氧的保护机制被破坏，Ｈ２Ｏ２ 大量积累，死细胞增多，最终造成植株干枯早衰，产量显著降低。 本研究结果可为突变基因Ｌｍｐａ１ 的基因功能及分子调控机制研究奠定一定的理论基础。

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