牛乳中乳源糖巨肽及β-酪蛋白的分离纯化

潘学春，黄 宇，钱成林

新希望乳业股份有限公司，四川成都 610011

0 引言

由于酪蛋白糖巨肽（CGMP）化学组成独特，不含苯环氨基酸，含有唾液酸和低聚糖，因此具有生理活性。从相关文献报道看，其活性（表达方式）主要有：①抗微生物活性；②糖巨肽中的唾液酸可抑制细菌和病毒在宿主细胞表面的附着和定植；③可与霍乱毒素和大肠杆菌毒素结合，降低其毒性；④能改善苯丙酮尿症患者的治疗效果[1～6]。由于CGMP具有生理活性，分离纯化CGMP具有一定的研究价值。

凝乳酶能特异性水解κ-酪蛋白，使牛乳中酪蛋白结构稳定性被破坏，得到酪蛋白沉淀和乳清层。κ-酪蛋白水解后得到疏水性副干酪和亲水性CGMP[7]，由于CGMP的亲水性，使其存在于乳清液层中，因此可从乳清中分离CGMP。文献中报道CGMP分离方法有：沉淀法、层析法及超滤法等[8～10]。综合考虑成本、硬件投入及试验环境要求等因素，本试验采用以三氯乙酸（TCA）作为沉淀剂的沉淀法，探索不同浓度TCA对CGMP的溶解性影响，以期得到一套CGMP的分离纯化工艺。

凝乳酶处理牛乳，排出乳清后得到沉淀，其主要成分是酪蛋白，含有较高比例的β-酪蛋白。若能从中分离出β-酪蛋白，则可增加β-酪蛋白分离的新途径，同时也能提升CGMP提取副产物的利用率。结合张艳等[11]从牛乳中分离β-酪蛋白的方法，本试验探讨从凝乳酶酶解后沉淀中分离出β-酪蛋白的工艺路径。

从相关文献报道可知，CGMP的检测方法包括比色法、间苯二酚法、电泳法及高效液相色谱法；β-酪蛋白的检测方法包括高效液相色谱法和电泳法。从实验室硬件基础、技术难度等方面分析后，本试验采用高效液相色谱法来测定CGMP和β-酪蛋白含量和纯度[12～14]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牛乳。β-酪蛋白标准品（sigma），CGMP、氯化钠（GR级）、凝乳酶（35 万U/g）、三氯乙酸（色谱纯）、三氟乙酸（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、95%乙醇（色谱纯）、丙酮（色谱纯）、β-巯基乙醇（色谱纯）、盐酸胍（色谱纯）。

1 mol/L氯化钠溶液：称取58.44 g氯化钠溶解于50 mL纯水中，纯水定容至100 mL混匀备用。

1%凝乳酶溶液：称取0.25 g凝乳酶溶解于15 mL 1 mol/L氯化钠溶液中，1 mol/L氯化钠溶液定容至25 mL，混匀备用，2～6 ℃保存。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（安捷伦1260）、LCMSMS（安捷伦6470）、恒温水浴锅、冷冻离心机、高速离心机、涡旋振荡器、0.45 µm PEFT滤膜。

1.3 方法

1.3.1 CGMP制备流程

新鲜牛乳→脱脂→加入凝乳酶→35 ℃酶解40～60 min→溶液B→加TCA溶液→离心→上清液C和沉淀D（含β-酪蛋白）。

上清液C→加TCA溶液→离心→CGMP沉淀→乙醇润洗→丙酮润洗→干燥→CGMP组分。

沉淀D→碱性复溶→降温→调节pH值（4.6）→冷冻离心→上清液→升温至30 ℃→常温离心→β-酪蛋白组分→纯水润洗→干燥→β-酪蛋白。

1.3.2 CGMP和β-酪蛋白分离

（1）TCA浓度对CGMP制备的影响

分别量取6 组相同体积、凝乳酶酶解离心后的上清液C，加入20%的TCA溶液或固体TCA，使上清液C中TCA[5]浓度分别为3%、5%、8%、10%、12%、14%，将6 组样品离心后，取上清液并用高效液相色谱法，测定溶液中CGMP含量。

（2）酶解后沉淀提取β-酪蛋白

沉淀D在pH值为11.0条件下复溶后，冷却至2～4 ℃，全程保持在5 ℃以下，调节pH值到3.5，经过4 ℃冷冻离心后，收集上清液至新的离心管中（如果是絮状物，可通过纱布或滤纸过滤）。水浴升温至35 ℃，如果室温较低（低于15 ℃），可将上清液温度升至40 ℃，常温离心得到β-酪蛋白固体，纯水润洗β-酪蛋白3 次以上，至纯水pH值为中性，60 ℃以下烘干，-18 ℃保存。

1.3.3 CGMP高效液相色谱法测定

（1）样品前处理

TCA沉淀后的CGMP溶液用0.45 µm PTFE滤膜过滤后，上机检测。

取适量待测CGMP样品，纯水溶解后，涡旋混匀，0.45 µm PTFE滤膜过滤后用于液相检测。

（2）液相色谱参数

色谱柱：300SB-CB 250★4.6 mm 5 µm；进样量：20 µL；柱温：40 ℃；检测波长：214 nm，辅助280 nm；流动相A：0.1 wt%三氟乙酸水溶液；流动相B：0.1 wt%三氟乙酸乙腈溶液；流速：1 mL/min。洗脱程序见表1。

表1 CGMP 高效液相色谱法洗脱程序

1.3.4 β-酪蛋白高效液相色谱法测定

（1）样品前处理

取适量待测样品加入490 µL的6 mol/L盐酸胍静置30～60 min后，再加入490 µL的4.5 mol/L盐酸胍和10 µL的β-巯基乙醇，混匀，0.45 µm PTFE滤膜过滤后用于液相检测。

（2）液相色谱参数

色谱柱：Vydac Everest C18 column，250×4.6 mm，5 µm，300 Å；进样量：50 µL；柱温：40℃；检测波长：214 nm，辅助280 nm；流动相A：0.1 wt%三氟乙酸水溶液；流动相B：0.1 wt%三氟乙酸乙腈溶液；流速：0.7 mL/min。洗脱程序见表2。

表2 β-酪蛋白高效液相色谱法洗脱程序

2 结果与讨论

2.1 不同TCA 浓度对CGMP 的影响分析

由表3可知，随着酶解液中TCA浓度逐渐升高，CGMP不断析出。当TCA浓度达到10%时，溶液中CGMP全部析出，因此选择10%作为CGMP的沉淀浓度能实现CGMP的最高回收率，同时消耗TCA最少。另外，对比不同TCA浓度处理酶解上清液检测色谱图（图1），当酶解液中TCA含量达3%时酶解液中CGMP的含量最高。

图1 CGMP 高效液相色谱图

表3 不同TCA 浓度对上清液中CGMP 含量测定汇总

综合上述结果，优化后的CGMP分离纯化工艺为：用3%的TCA沉淀酶解液中杂质，通过离心分离酶解后溶液中的杂质。继续提高上清液中TCA浓度到10%，离心收集沉淀，经过润洗后得到纯度较高CGMP固体。收集分离纯化后的CGMP固体，经高效液相色谱法检测，CGMP纯度为80%～90%。

2.2 β-酪蛋白的提取

牛奶经过凝乳酶酶解后得到沉淀D，在碱性条件下复溶后制备成蛋白液，经过低温处理、pH值调节、冷冻离心、升温及常温离心后得到最终β-酪蛋白固体，通过高效液相色谱法测定其纯度为8 5%～9 0%，高效液相色谱图见图2。

图2 β-酪蛋白高效液相色谱图

利用β-酪蛋白在低温低酸性条件下游离的特性，本文采用凝乳酶酶解后的固体产品为原料，通过碱性复溶、低温调酸、冷冻离心、升温、常温离心、水洗等操作后得到纯度较高的β-酪蛋白。对比张艳等[11]以酪蛋白为原料通过钙盐沉淀，经过多次溶解沉淀得到较高纯度的β-酪蛋白，本方法仅需要一次溶解和沉淀操作就能得到较高纯度的β-酪蛋白，操作方便，效率更高。另外对比李武祎等[15]通过尿素拆解法，不需喷雾干燥等操作。

3 结论

本文通过乳品生产中常见的凝乳酶处理后得到的液体和固体产物，利用CGMP在不同浓度TCA中的溶解度差异，对CGMP分离纯化，同时利用β-酪蛋白在低温低酸性条件下能游离的特性，实现β-酪蛋白的分离纯化。

通过增加TCA浓度实现CGMP的分离与纯化，对比试验结果显示，采用3% TCA可有效沉淀酶解后上清液中溶解的杂质（主要是牛乳中的乳清乳白类蛋白质），再经过离心后得到纯度较高的CGMP溶液，最后采用10% TCA沉淀出CGMP固体，得到的CGMP固体需通过乙醇和丙酮润洗去除沉淀中残留TCA，避免TCA对CGMP的分解。通过高效液相色谱法测定CGMP含量，考虑到无商品化的CGMP标准品，本试验通过高效液相色谱法测定目标物的峰面积进行辅助验证，通过色谱图峰面积比值来测算目标产品的色谱纯度，最终得到目标产物的色谱纯度为80%～90%。

采用酶解后的沉淀为原料直接分离得到较高纯度的β-酪蛋白，除试验方法简便高效外，扩展分离β-酪蛋白的原料选择。另外酶解后固体中除含有β-酪蛋白外，还含有αs-酪蛋白，对于固体中αs-酪蛋白的分离纯化，有待研究。