干酪用牛凝乳酶替代品的研究进展*

普燕，张富春

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆乌鲁木齐，830046)

凝乳酶(milk clotting enzyme，MCE)，广义上讲是指能使乳液凝固的一类酶，被广泛用于干酪加工初期的凝乳过程。凝乳酶由于来源不同，为了便于区分，进行如下定义:狭义上的凝乳酶(EC3.4.23.4)称为chymosin，表示由哺乳动物体内chymosin基因表达出的凝乳酶。从新生小动物(皱)胃中提取的天然的具有凝乳功能并用于干酪生产的酶制剂称为rennet或皱胃酶粗提物，它的成分主要包括chymosin和胃蛋白酶，其中chymosin的含量约占50% ～95%［1］，这因不同提取纯化工艺乃至提取动物年龄不同而有所差异，随着纯化工艺技术的革新，一般chymosin可达90%以上［2］。有很多来自植物和微生物的蛋白酶也具有凝乳功能，这些酶被称为植物凝乳酶(plant coagulant，PC)和微生物(microbial coagulant，MC)(除特殊说明外，文中凝乳酶仅指chymosin)。

凝乳酶(chymosin)由未断奶哺乳动物胃粘膜基底腺细胞分泌，起初是酶原(prochymosin)形式，没有活性，在胃酸的酸性环境中，能够自剪切形成有活性的成熟凝乳酶［2］，有效地凝固乳液，这对新生小动物是非常关键的，凝固的乳液可以在消化道存留更长的时间，有利于小动物对母乳营养的充分吸收［2］。凝乳酶能特异切割乳液中的κ酪蛋白肽链的Phe105和Met106 之间的肽键［1，2］，导致乳液中酪蛋白颗粒凝聚沉淀。利用其这一特性，凝乳酶很早就被应用到干酪的制备中。凝乳酶一般具有高凝乳活性(clotting activity)和低非特异蛋白水解活性(nonspecific protease activity)，二者比率称为c/p值，是评价凝乳酶制备干酪品质优劣的常用指标，因为高c/p可以得到较高的干酪出品率，同时，蛋白水解活性也对干酪成熟期质地和风味的形成有重要影响。牛凝乳酶因为其有较高的c/p值以及制备干酪的品质优良［3］，一直以来被认为是制备干酪的最佳凝乳酶。随着干酪市场的增长，小牛rennet供应不足，小牛凝乳酶的替代品应运而生。这些替代品包括其他动物rennet、植物凝乳酶、微生物凝乳酶和重组凝乳酶(recombinant chymosin)。

本文着重从凝乳酶的结构研究、重组凝乳酶的克隆、表达量和种类、植物与微生物凝乳酶在干酪加工中的应用等方面阐述干酪用牛凝乳酶替代品的研究进展。

1 凝乳酶的结构研究

1.1 凝乳酶的结构

目前已经得到了凝乳酶的晶体结构［4］。凝乳酶共含有323个氨基酸，1-175位和176-323位分别折叠成凝乳酶N端和C端两个结构域，其间通过氢键作用使凝乳酶整体构成一个双叶型的结构，两片叶瓣中央是酶与底物结合的裂隙，行使催化功能的两个天冬氨酸Asp34和Asp216位于裂缝中间［4-5］。

1.2 凝乳酶原的活化

凝乳酶在体内首先是合成凝乳酶原前体(pre-prochymosin)，以牛凝乳酶原前体为例，其编码381个AA，N端的16个AA为信号肽，当酶被分泌到胃中，该信号肽则被剪切除去，形成没有活性的凝乳酶原。凝乳酶原包含365个AA，分子量为40.777 kDa。凝乳酶原在胃的酸性环境下，发生构象改变并自剪切形成有活性的凝乳酶，同时释放N端42个AA(被称为激活片段，activation segment或propeptide)，故最后成熟的凝乳酶含有323个AA，分子量为35.6 kDa［2］。

目前认为凝乳酶原的活化过程为:propeptide与酶的活性位点以静电作用结合，propeptide的存在阻止了底物进入酶活性中心，故酶原在中性环境中不具有催化作用;当pH降低，propeptide与酶活性中心的静电作用被破坏，此时propeptide的构象发生改变，酶原的自剪切位点暴露并与酶活性中心结合，酶对该位点进行切割，propeptide从酶活性中心解离，酶的N端发生构象改变，形成一个反式β折叠位于底物与酶结合的裂隙处［6］。同时，Christensen 等［7］还发现酶原激活既可以是分子内的，也可以是分子间的。

1.3 凝乳酶的进化

凝乳酶本质是一种胃消化酶，与其他胃消化酶都是以酶原的形式分泌，在胃液的酸性环境下自剪切形成有活性的酶。根据已测序确定的胃消化酶核酸序列分析得出:不同的消化酶均来自同一天冬氨酸蛋白酶祖先，胃亚蛋白酶原首先分化出来，然后是凝乳酶原，胃蛋白酶原A和胃蛋白酶原F亲缘较近［8］。

根据genbank公布的动物凝乳酶氨基酸序列，利用MEGA4.0软件构建凝乳酶系统进化树，结果见图1，可以看出凝乳酶的进化与传统的动物分类学极其吻合。

2 重组凝乳酶

重组凝乳酶(recombinant chymosin)，也被称为发酵生产的凝乳酶(fermentation produced chymosin，FPC)，其过程是分离获得动物凝乳酶mRNA，反转录出cDNA，将其构建到表达载体上，转化宿主进行表达，再经酶原活化和纯化获得有活性的重组凝乳酶。

美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)通过全面审查发表的文献资料得出结论，大肠杆菌K-12表达的重组牛凝乳酶与天然凝乳酶在组分与纯度方面没有差异［2］，从而该酶成为第1个被美国食品药品管理局批准用于食品的重组酶［9］。现在已有3个重组牛凝乳酶符合美国食品药品管理局条例并认为是安全(GRAS)的被用于干酪生产，它们是 Escherichia coli K-12(大肠杆菌 K-12)、kluyveromyces marxianus var.lactis(马克斯克鲁维酵母变种)和Aspergillus niger(黑曲霉)表达的重组牛凝乳酶［9］。目前，这些酶由美国辉瑞(Pfizer)、荷兰帝斯曼食品配料部(DSM Food Specialties)、丹麦科汉森(Chr.Hansen)等公司生产。重组凝乳酶比较其他小牛凝乳酶的替代品有这样一些优势:蛋白水解活性低、凝乳过程的可预测性、符合犹太教规、受到素食主义者欢迎、符合宗教情感和动物权益的保护，且重组凝乳酶的纯度高(含100%凝乳酶)，产量高［2］，故重组凝乳酶已经成为小牛rennet最佳替代品。

因为小牛rennet制作干酪品质优良且有一定传统，利用基因工程手段生产的动物凝乳酶首先是从克隆表达小牛凝乳酶开始。其研究广泛，积累了很多蛋白表达的经验，虽然重组牛凝乳酶已经生产上市二十余年，但关于重组牛凝乳酶的表达一直没有停止，选用新宿主、新表达载体、优化培养基、突变宿主菌基因、融合蛋白表达等表达方法的研究，不仅提高了重组牛凝乳酶的表达量，同时也改进了异源蛋白表达方法，对异源蛋白的高水平表达提供了有效的参考。

2.1 重组牛凝乳酶的表达研究

2.1.1 原核表达

Emtage等［10］利用大肠杆菌表达牛凝乳酶原，酶原以包涵体表达，占总菌蛋白的1% ～5%，通过溶解复性和激活步骤，最终获得有活性的成熟的凝乳酶。小牛凝乳酶由此成为第一个通过原核表达并纯化获得的有活性的真核生物蛋白。Tichy等［11］提出了从包涵体中回收高产量有活性重组凝乳酶的最优方案:包涵体用8 mol/L尿素(pH10.4)溶解，并放置31℃1 h。同时，如果要让重组凝乳酶原正确复性，复性液中最终的尿素浓度不得超过0.32 mol/L，以及蛋白含量不超过0.275 mg/mL。这样的溶解和复性条件可以使成熟凝乳酶的产量比其他方法获得的产量提高8倍多。关于大肠杆菌中表达重组牛凝乳酶原的复性与纯化方法还可以参见专利［12-13］。

2.1.2 真核表达

凝乳酶是真核生物基因，选用真核表达系统也获得了有活性的重组牛凝乳酶，并且酶原以分泌形式表达，有的酶原分泌后自剪切形成有活性的凝乳酶，无需后续的活化处理。目前已经成功表达出具活性的重组牛凝乳酶真核表达系统的有:酿酒酵母［14］、毕赤酵母［15-16］、克鲁维酵母［17-18］、黑曲霉［19-20］、米黑根毛霉［21］、米曲霉［22-25］、泡盛曲霉［26-27］乃至转基因羊的羊乳［28-29］。

图1 动物凝乳酶基因序列进化树Fig.1 The evolutionary tree of the chymosin gene

Ward等［26］将牛凝乳酶融合到葡糖糖化酶(glucoamylase)的C端，在泡盛曲霉中表达，提高了凝乳酶的分泌量。同时融合蛋白分泌后自动剪切形成有活性的成熟凝乳酶。Tsuchiya等［22］用米曲霉丝状真菌(Aspergillus oryzae)表达小牛凝乳酶原时，从上清液中获得分泌的有活性凝乳酶，酶原自激活产生凝乳酶，产量为0.07 ～0.16 mg/L。Tsuchiya等［23］融合葡萄糖化酶到酶原N端，提高了小牛凝乳酶的分泌量。深层培养，融合有葡萄糖化酶(1-511位氨基酸)的牛凝乳酶原比较凝乳酶原基因直接构建到glaA启动子下游的表达载体转化菌，牛凝乳酶的产量高出4倍。使用小麦麸固体培养系统比深层培养牛凝乳酶产量高500倍，可达150 mg/kg麦麸。Ohno等［24］在牛凝乳酶基因前融合1个内源丝状真菌分泌蛋白α-淀粉酶(α-amylase)作为运载体(carrier)，在米曲霉宿主中表达，结果牛凝乳酶的表达量约为对照的2倍。基因芯片显示运载体的融合显著上调了有关内质网蛋白折叠和分泌的基因。

Mariani等［21］用米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)NRRL 3169表达重组牛凝乳酶，经过优化培养条件，产量在168 h时达884 SU/mL，若机械搅动发酵罐，产量最高达1 160 SU/mL。

Harmsen等［14］在酿酒酵母中共表达凝乳酶识别的美洲驼单域抗体片段，刺激牛凝乳酶的分泌量增加了1.5～6倍。Kosalková等［27］用泡盛曲霉分泌表达凝乳酶时，在培养基中添加酪蛋白或酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides，CPPs)，可以使凝乳酶的分泌量提高40到80倍，可能是CPPs造成了细胞代谢基因的重排，从而导致胞外蛋白的大量分泌。

Bodie［19］通过准性重组提高黑曲霉(Aspergillus niger var.Awamori)凝乳酶表达量。van den Brink［20］通过糖基化提高凝乳酶在黑曲霉中的产量。在凝乳酶内部糖基化，产量可提高1倍，在凝乳酶分子外部糖基化也提高了重组凝乳酶的产量。

Yoon等［25］通过缺陷丝状真菌米曲霉的自噬基因从而提高牛凝乳酶的表达量3倍多。但是由于自噬基因缺陷导致分生孢子的产量降低，而分生孢子是大规模接种必需的，故作者构建了1个条件缺陷自噬基因的菌株。该菌株的自噬基因启动子区被替换为硫胺素控制的thiA启动子。缺乏硫胺素时，分生孢子产生量明显增加，当存在硫胺素时，自噬基因被抑制，表现出凝乳酶产量的增加，这种调控自噬基因的方法能有效提高外源蛋白在米曲霉中的表达。

ZHANG等［15］第 1次在毕赤酵母中利用pPICZαA表达载体表达牛凝乳酶原，并获得有活性的培养上清，活性为 12.2 SU/mL。Noseda等［16］将密码子优化的牛凝乳酶原序列构建到pIC9K表达载体上，转入毕赤酵母GS115中表达，通过优化表达条件，发酵可得到240 g/L菌体干重，凝乳酶(直接分泌出有活性的凝乳酶，无需激活)量为53 mg/L(甲醇诱导表达120 h)。通过3kDa的超滤和高效凝胶过滤层析纯化，最终总活力回收率为56%。纯化过程中出现酶活力提高的情况，被推测是去除了凝乳酶的假定的抑制剂或蛋白酶。FENG等［17］用克鲁维酵母GG799表达重组牛凝乳酶，酶活达80 U/mL，对密码子进行优化后，凝乳酶的产量提高了7倍多，达到575 U/mL。FENG［18］等通过将克鲁维酵母 GG799中的PMR1基因致缺陷，使酵母分泌的凝乳酶产量提高，活性从80 U/mL提高到496 U/mL。

2.1.3 转基因羊乳

Mezina等［28］用离子交换层析和生物亲和层析分离转基因羊乳中的牛凝乳酶，获得了均质有活性的凝乳酶，从氨基酸组成、分子量、pH值的稳定性、蛋白底物的催化活性等方面进行分析，结果显示转基因羊乳中提取的牛凝乳酶与天然牛凝乳酶相同。Starovoitova等［29］检测转基因羊乳中提取的牛凝乳酶和克鲁维酵母表达的重组牛凝乳酶催化荧光底物的情况，发现二者对低分子量的底物催化情况不同，但对蛋白底物的催化无差别。同时Pepstain抑制重组凝乳酶要比抑制天然凝乳酶效率低。

2.2 其他动物重组凝乳酶的表达研究

一般干酪加工原料牛乳居多，也有水牛乳、羊乳和驼乳等，故选择水牛、羊、骆驼这些动物的凝乳酶进行研究，一方面用于这些动物乳的干酪制作，另一方面，这些动物在系统分类学上与牛有比较近的亲缘关系(从图1也可看出)，可能会对牛乳有较好的凝固作用。

2.2.1 重组绵羊凝乳酶

Rogelj等［30］表达获得了重组绵羊凝乳酶，同时与商品化重组牛凝乳酶、牛rennet和微生物凝乳酶比较凝乳活性和蛋白水解活力。结果:4种酶对pH反应相似，最适凝乳温度为重组绵羊凝乳酶为40℃，牛rennet和重组牛凝乳酶为45℃，微生物凝乳酶为60℃。水解活性比较，重组绵羊凝乳酶低于牛rennet，与重组牛凝乳酶无显著差别。重组绵羊凝乳酶低蛋白水解活性没有对干酪的感官特性产生负面影响，总体上看重组绵羊凝乳酶制备干酪至少比得上重组牛凝乳酶制备干酪，同时这两种干酪又比牛rennet制备干酪得分高。

2.2.2 重组山羊凝乳酶

Vega-Hernández等［31］从小山羊的皱胃中克隆获得了山羊凝乳酶原前体序列，并对序列进行了鉴定，用克鲁维酵母和酿酒酵母表达山羊凝乳酶原，经体外酸化激活后有凝乳活性，且山羊凝乳酶能特异水解牛乳κ-酪蛋白。Eskandari等［32］同样从小山羊的皱胃中克隆获得了山羊凝乳酶原前体序列，并与其他学者克隆的序列进行了比较。将山羊凝乳酶原cDNA克隆到pET28a上(表达的凝乳酶原带his或不带his标签)，在大肠杆菌中表达，酶原以包涵体形式表达，再通过后续的复性与激活，获得有活性的重组山羊凝乳酶。这些原核表达复性与激活的过程与重组牛凝乳酶相似。作者还发现，带his标签的酶原与不带his标签酶原激活后的凝乳酶凝乳活力分别为416 U/mg和192 U/mg，可能是his标签影响了propeptide的电荷以及propeptide与酶之间的静电作用，从而导致酶的折叠与活性的改变。

Vallejo等［33］比较了4种重组凝乳酶的酶学特性——牛、水牛、山羊和骆驼重组凝乳酶，认为山羊重组凝乳酶最适合替代牛凝乳酶用于干酪工业，原因是其几乎不被糖基化，在不同的pH条件下都能保留高的凝乳活力，同时该酶是这4种重组凝乳酶中催化效率最高且对牛κ-酪蛋白作用最特异的酶［33］。

2.2.3 重组水牛凝乳酶

Vallejo等［34］从哺乳小水牛的皱胃中提取RNA，反转录获得凝乳酶原前体、凝乳酶原和凝乳酶的DNA序列，将这3条序列都克隆到pGAPZαA表达载体上，转化到毕赤酵母GS115中表达，只有克隆了酶原的表达载体转化的酵母上清获得了有活性的酶，且无需体外激活处理。同时表达的凝乳酶条带在40和36 kDa处，用糖类内切酶H(endoglycosidase H)处理，转变为36 kDa单一条带，说明40 kDa是凝乳酶的糖基化形式。重组水牛凝乳酶的最适pH为4.5，最适作用温度为37℃。Vallejo等认为该毕赤酵母直接分泌表达出有活性的凝乳酶而无需后续的活化步骤，故该重组菌是干酪工业极好的候选重组凝乳酶的生产菌株。

2.2.4 重组骆驼凝乳酶

2006年，Kappeler等［3］首次从单峰驼(Camelus dromedarius)体内克隆了凝乳酶基因序列，将凝乳酶原序列克隆到表达载体上转入黑曲霉(Aspergillus niger)中表达，获得的蛋白用N端测序证明蛋白长度和N端的G均与牛凝乳酶相同，SDS-PAGE电泳显示分子量为40 kDa和少量36 kDa蛋白，说明该酶主要是糖基化形式。比较重组骆驼凝乳酶和重组牛凝乳酶，发现骆驼凝乳酶对牛乳的凝乳活力比牛凝乳酶高70%，但非特异蛋白水解活力才相当于牛凝乳酶的20%，计算得出骆驼凝乳酶的c/p值是牛凝乳酶的7倍。

至此，骆驼凝乳酶是第一个被发现凝乳活力比牛凝乳酶高而蛋白水解活力比牛凝乳酶低的动物凝乳酶，故用骆驼凝乳酶制备干酪以及关于骆驼凝乳酶与底物的结合研究受到关注。目前重组骆驼凝乳酶已经上市出售，成为牛凝乳酶的成功替代品。

3 植物和微生物凝乳酶

一般认为植物凝乳酶和微生物凝乳酶的蛋白水解活性比牛凝乳酶高，故用于干酪制作可能导致过度水解使得干酪出品率低，质地较差，甚至产生苦味。但是利用蛋白水解活性高的特点，研究发现有些酶可以添加到干酪中作为促熟剂，甚至可以对苦味肽进行降解，同时有些酶还可以用于新乳品的开发或进行干酪的固定化生产。

3.1 干酪促熟

JIANG等［35］在糯米酒中通过离子交换层析分离出一种类rennet酶(rennet-like enzyme)，研究其对乳酪蛋白、乳清蛋白的水解特性以及对 κ-、β-、α-酪蛋白的作用肽键，发现α-酪蛋白几乎完全降解，而κ-、β-酪蛋白在12 h后仍部分降解，检测发现该酶作用κ-酪蛋白的Thr94-Met95，不同于大多数凝乳酶作用的 Phe105-Met106。Jiang等［36］分析其结构，发现该酒rennet为无糖基化的单体，N端测序显示与其他真菌凝乳酶有较高程度的相似性，其对氧化型牛胰岛素B链(oxidized insulin B chain)的切割位点与毛霉菌凝乳酶(Mucor rennet)相似，与牛凝乳酶不同。比较酒rennet、牛凝乳酶和毛霉菌凝乳酶水解牛酪蛋白的作用情况，凝乳效果相似，但速率不同。在pH6.5，40℃时，酒rennet比其他两种酶有更强的降解作用，因此，酒rennet可能作为小牛凝乳酶的辅剂或干酪成熟的促熟剂。

An等［37］用从解淀粉芽孢杆菌中提出的微生物凝乳酶和牛rennet制作微型切达干酪并进行比较，除了pH，大体成分二者没有差别。干酪成熟40 d和60 d检测，牛rennet制作干酪的pH高，而微生物凝乳酶制作干酪的pH4.6可溶性氮高。两种干酪的12%TCA可溶性氮含量相似。检测乙醇可溶和不溶组分，微生物凝乳酶制备干酪的疏水/亲水残基的比率低，且质地更软，故杆菌凝乳酶有更高的蛋白水解率，能缩短干酪成熟时间。

Abellan等［38］用植物凝乳酶——朝鲜蓟的提取物cyprosins替代动物凝乳酶来制作传统西班牙和葡萄牙干酪，发现其可以提高成熟期的游离脂肪酸的含量，作者建议可以利用cyprosins在成熟期的高水解活性来加速Murcia al Vino羊乳干酪的成熟。

Mazorra-Manzano等［39］比较猕猴桃、甜瓜和生姜的提取物制作新鲜干酪的情况，结果显示猕猴桃提取物制备的凝乳与商业化rennet制作的凝乳特性最相似，甜瓜提取物制作的凝乳质构数据都很低，可能与其高水解活性以及低c/p值有关，不适合做新鲜干酪，但是它制备的凝乳具有柔软似冰激凌的质地，也许可以作为一种凝乳剂用于制备其他干酪，如奶油乳酪，或者用于开发新质地的乳制品。

3.2 降低苦味

Rossano［40］等从亚得里亚海南部的甲壳动物(crustaceans)——刺铠虾属(Munida)的肝胰腺提取的消化酶具有酪蛋白水解活性。该类酶包括几种近似异胰蛋白酶(isotrypsin-like)、异胰凝乳酶蛋白酶(isochymotrypsin-like)以及氨肽酶、羧肽酶 A和 B。这些消化酶能降解β-酪蛋白来源的 f193-209肽，而该肽被认为与干酪中的苦味相关，揭示其有潜力应用到某些干酪工艺中以降低苦味。该酶来源充足，同时从深海动物中提取，具有低温活性，故用于食品工业能避免细菌污染和有害的化学反应［41］。

3.3 酶的固定

Pessela等［42］研究凝乳酶的固定化，其基于米黑毛霉(Mucor miehei)凝乳酶的糖链将酶共价连接到支持物上，该糖链作为天然的间隔臂，使凝乳酶保持较高活力，对小分子量底物(H-Leu-Ser-p-nitro-Phe-Nle-Ala-Leu-OMe)的切割效率为98%，对大分子量底物(κ-酪蛋白)的切割效率为78%。控制酶切反应在4℃进行，此时水解的酪蛋白不会沉淀，可以防止乳与酶未分离就凝固，再将水解乳液过滤，加热到30℃，能得到相似于可溶rennet凝乳产生的凝乳块。

4 展望

干酪市场的增长不断推进牛凝乳酶替代品的研发，同时这些酶的研究也促进了干酪工业的进步。例如，重组牛凝乳酶的高纯度使得用其制备的干酪质地比牛rennet更优良;随之发现重组骆驼凝乳酶，c/p比牛凝乳酶更高，制备干酪苦味更少，已经用于低脂干酪的质地与风味改进研究［43-46］;一些植物凝乳酶和微生物凝乳酶虽然不能替代牛凝乳酶，但是可以作为牛凝乳酶的辅剂或干酪的促熟剂，甚至有些可以用于开发新乳制品。

利用基因突变或蛋白质工程手段可以对牛凝乳酶进行人为改造，比如改变酶催化的最适pH［47-48］、改变酶的激活模式［49］，还可以改变底物与酶结合的亲和力等［50］，使酶的特性更适合制备品质优良的干酪或乳制品。

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