过表达葡萄糖调节蛋白78 人乳腺癌细胞系HS578T、MDA-MB-231的构建

李艳敏，古丽拉莱·多力坤，马西智，杨文月，单文豪，陈娜菲，周晓涛，2

1 新疆医科大学基础医学院免疫学教研室，乌鲁木齐 830011；2 新疆地方病与分子生物学重点实验室

乳腺癌是一种乳腺上皮组织恶性肿瘤，发病率已跃居全球恶性肿瘤发病率首位，是目前全世界女性癌症死亡的主要原因[1-2］。三阴性乳腺癌是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）表达都是阴性的的一种乳腺癌特殊亚型。80%～90%三阴性乳腺癌的病理为基底样型乳腺癌[4］，占乳腺癌总数的15%～20%[5］。三阴性乳腺癌具有恶性程度较高、早期即可发生内脏转移及骨转移、复发率较高等特点，多数患者确诊时病情已经进展至晚期，预后较差[6-7］。手术结合放化疗、靶向治疗等辅助方法的综合治疗是目前临床常用的三阴性乳腺癌治疗方法，但治疗效果不佳，患者预后较差。葡萄糖调节蛋白 78（glucose regulated protein 78kD，GRP78）属于热休克蛋白Hsp70 亚家族[9］，是内质网标志性应激蛋白之一。内质网应激（ERS）时肿瘤细胞为了重建内质网的稳态和功能，细胞会启动未折叠 蛋 白 反 应（unfolded protein response，UPR）。GRP78 是ERS 的关键蛋白，在ERS 时被大量诱导表达，协助UPR，发挥肿瘤细胞的自我保护作用，使其在应激环境中存活[10］。长期或严重的ERS 超出UPR 的负荷时，GRP78 则会通过活化ERS 凋亡通路来诱导细胞凋亡[11］。研究[12］发现，乳腺肿瘤组织中GRP78 高表达。进一步研究[14］发现，GRP78 的表达与乳腺癌细胞的侵袭性正相关，敲除细胞GRP78 基因后乳腺癌细胞的侵袭、转移能力明显下降。研究[15-16］报道发现，抑制 GRP78 蛋白表达可逆转乳腺癌的多重耐药，降低肿瘤细胞的侵袭转移能力。因此，研究GRP78 在乳腺癌侵袭转移中的具体作用机制，对乳腺癌转移的治疗新方法的研究提供了新方向。HS578T、MDA-MB-231 是目前较为经典的、具有高度迁移和侵袭能力的人乳腺癌细胞系，常用于三阴性乳腺癌的基础研究。2023年6—9月，我们构建了GRP78过表达的HS578T 、MDA-MB-231细胞系，旨在为后续研究GRP78 蛋白在三阴性乳腺癌迁移、侵袭中的作用提供基础，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒、试剂及仪器 293FT 细胞系（克隆分离株）、HS578T 细胞系、MDA-MB-231 由本实验室冷冻保存。pDONR223-HSPA5 质粒载体购自美国Sigma，Xba Ⅰ、EcoR Ⅰ和Not Ⅰ限 制 性 内 切 酶、DNAmarker、BCA蛋白定量试剂盒购自购自中国赛默飞世尔科技；质粒提取试剂盒购自北京天根；蛋白质Maker 购自上海臻诺生物科技；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒购自北京Solarbio 科技有限公司；PVDF 膜购自美国默克；细胞培养基、胎牛血清购自美国Biological Industries；PCR鉴定试剂盒购自大连TaKaRa。

1.2 过表达GRP78 慢病毒载体pCDH-CMVGRP78-HA-EF1-Puro的构建及鉴定

1.2.1 pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 的 构 建参考pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro（病毒骨架载体，含有包装信号，具有氨苄霉素抗性）的MCS 区和pDONR223-HSPA5-WT（GPR78）目的基因CDs 区，选择EcoRⅠ、NotⅠ两个酶切位点。根据GPR78 目的基因序列与EcoRⅠ、NotⅠ两个酶切位点设计并合成一对特异性引物，上游引物为5'-CCGGAATTCATGAAGCTCTCCCTGGTG-3'（下划线处为酶切位点EcoRⅠ），下游引物为5'-TAAAGCGGCCGCGGCGTAGTCAGGCACGTCGTAAGGATACAACTCATCTTTTTCTGCTGT-3'（下划线处为酶切位点NotⅠ）。采用PCR 法扩增目的基因GRP78，使用EcoRⅠ和Not Ⅰ限制性内切酶分别切割pCDH-CMVMCS-EF1-Puro（切割后得到线性化载体CDH-CMVHA-EF1-Puro）和GPR78 基因PCR 产物。运用同源重组克隆技术将具有相同末端序列的CDH-CMVHA-EF1-Puro 和GRP78 插入片段连接，最终构建得到pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro。扩增目的基因GRP78 后得到2 006 bp 左右的目的条带，符合预期结果。以pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro 为病毒骨架载体，含有包装信号，具有氨苄霉素抗性。利用EcoRⅠ和NotⅠ酶切pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro 和目的基因片段GRP78，得到线性化载体骨架，分子量在7 352 bp左右，插入片段分子量在2 006 bp左右。

1.2.2 pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 的 鉴 定取大肠埃希菌，加入“1.2.1”中构建得到的pCDHCMV-GRP78-HA-EF1-Puro 共培养，取大肠埃希菌感受态细胞涂布，培养12 h 挑取阳性单菌落，接种于5 mL 含有 50 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，37 ℃、220 r 培养过夜，离心收集菌体沉淀，按质粒小提试剂盒说明书操作提取质粒。采用PCR 法扩增质粒，上游引物：5'-CCGGAATTCGCCACCATGAAGCTCTCCCTGGTG-3'（下划线处为酶切位点EcoR Ⅰ）；下游引物：5'-TAAAGCGGCCGCGGCGTAGTCAGGCACGTCGTA-3'（下划线处为酶切位点NotⅠ）。PCR 总反应体系为50 μL：cDNA5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，PreMix 25 μL，ddH2O 18 μL。使用EcoRⅠ重组质粒pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 进行单酶切， XbaⅠ和NotⅠ限制性内切酶进行双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并送上海生工生物工程股份有限公司测序，鉴定pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 是否构建成功。

1.3 GRP78 过表达的HS578T 、MDA-MB-231 细胞系构建

1.3.1 GRP78 慢病毒颗粒制备 取对数生长期293FT 细胞按照4.2×106～4.3×106的数量均匀铺入6 cm 细胞培养皿中。将pCDH-CMV-GRP78-HAEF1-Puro 混合液逐滴均匀加入293FT 细胞培养皿中，37 ℃孵育培养6 h 换液。显微镜下观察GRP78慢病毒颗粒包装情况，可看到随培养时间延长，293FT 细胞逐渐愈合，细胞内出现空泡，在上清中含有高浓度的病毒颗粒. 培养48 h收集含GRP78慢病毒颗粒的上清液，4 000 r/min、4 ℃离心5 min，取上清，分装到无菌EP管中，-80 ℃保存备用。

1.3.2 GRP78 过表达的HS578T 、MDA-MB-231 细胞系的构建方法 取对数生长期HS578T、MDAMB-231 细胞按照0.4×106的密度接种于3.5 cm 细胞培养皿中，培养24 h 后将含GRP78 慢病毒颗粒的上清液与培养基按照2∶1 比例，通过pB 转染到细胞里，转染24 h后更换培养基。转染48 h后，在培养基中加入1∶500 稀释嘌呤霉素，每2 天换液1 次，维持嘌呤霉素浓度为1∶2 000，筛选GRP78 过表达的HS578T 、MDA-MB-231细胞系。

1.3.3 GRP78 过表达的HS578T 、MDA-MB-231 细胞系鉴定 ①采用Western Blotting 法检测“1.3.2”中HS578T 、MDA-MB-231 细 胞GRP78。 收 集“1.3.2”中感染pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 慢病毒的HS578T、MDA-MB-231 细胞，加入完全细胞裂解液充分裂解获取总蛋白。采用BCA 试剂盒测量蛋白浓度后，每组取20 μL 蛋白进行12%SDSPAGE 凝胶电泳后转移至孔径为PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，1×Tris-盐酸缓冲液（TBST）间隔15 min，重复洗涤3 次；加入一抗4 ℃摇床孵育过夜，1×TBST 间隔15 min，重复洗涤3 次；加入HRP 标记的二抗避光室温孵育2 h，1×TBST 间隔15 min，重复洗涤3 次；加入ECL 显影，观察并记录结果。②HS578T 细胞GRP78 蛋白亚细胞定位观察 采用激光共聚焦显微镜观察HS578T 、MDA-MB-231 细胞GRP78 蛋白亚细胞定位。与MDA-MB-231 乳腺癌细胞相比，HS578T 细胞体积较大，可用于细胞内分子定位。在24 孔细胞培养板上放好圆形细胞爬片，用多聚赖氨酸浸润爬片后吸取去除，以每孔4×105密度接种GRP78 过表达的HS578T 细胞。PBS洗涤2 次，加入4%多聚甲醛固定细胞，室温静置15 min，1×PBS 洗涤3 次；小心取出玻片放置入孵育盒中，用含0.1%的Triton X-100 室温通透20 min，1×PBS 洗涤3 次；加5% BSA 的封闭液加入培养皿中封闭1 h，弃去封闭液，滴加稀释好的鼠源anti-HA，4 ℃孵育过夜；1×PBS 洗涤3 次，滴加稀释的荧光二抗（抗鼠IgG-FITC），37 ℃孵育30 min；1×PBS 洗涤3 次，DAPI 工作液室温避光孵育 5min，1×PBS 洗涤3 次，再加ddH2O 清洗2 次，滴加甘油并用透明指甲油封片，待完全干燥后使用激光共聚焦显微镜对HS578T 细胞中GRP78 蛋白进行定位，其中绿色荧光信号代表GRP78 蛋白，其中蓝色荧光为细胞核。

2 结果

2.1 pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 的鉴 定 结果 pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 的PCR 产 物电泳结果可见分子量2 006 bp 左右的产物（见图1A）；EcoRⅠ单酶切电泳图酶切产物分子量约为9 369 bp，与目的条带相符（见图1B）；XbaⅠ和NotⅠ双酶切电泳图酶切产物分子量分别为7 352、2 017 bp，与目的条带相符（见图1C）。测序结果显示，比对序列与HSPA5碱基序列100%符合，表明GPR78基因片段成功连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上，pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro 质粒构建成功。

图1 pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro的鉴定结果

2.2 HS578T、MDA-MB-231 细胞系GPR78 蛋白表达结果 定性检测结果为HS578T、MDA-MB-231 细胞系中在78 kd 左右可见明显电泳条带（见图2），说明HS578T 、MDA-MB-231细胞系中成功表达GPR78蛋白。定位检查结果可见，外源性的GPR78 蛋白在HS578T细胞中稳定表达，且主要分布在细胞质中。

图2 HS578T、MDA-MB-231细胞系GPR78蛋白电泳图

3 讨论

乳腺癌是全球女性癌症主要致死原因之一，我国女性人口众多，乳腺癌发病率和死亡率较高，成为公共卫生防控的主要负担[17-18］。乳腺癌发病机制十分复杂，涉及多个癌基因、抑癌基因的异常表达，目前已发现许多与乳腺癌相关的基因，例如：p53、肿瘤转移相关基因（MTA1）、黏附分子 （CD44）和热休克蛋白（HSP70、HSP90 和GRP78）等[19-21］。因此，探索该类分子生物学表达，可以指导肿瘤的基因靶向治疗，具有重要临床价值。FERNANDEZ 等[22］研究发现与正常乳腺组织相比，大多数恶性乳腺肿瘤组织中GRP78mRNA 和蛋白均过表达。67%的乳腺癌患者在化疗前表达高水平的GRP78，并表明GRP78 阳性与乳腺癌短期的复发有存在关联[23］。

质粒是基因工程中常用的工具载体，人工构建的质粒可以集多种特性于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等[24］。常用的质粒载体有克隆载体、原核表达载体、真核表达载体、酵母表达载体与病毒表达载体[25］。其中真核表达质粒的转染对于分裂增殖比较旺盛的体外培养细胞转染效果较好，但表达的目的基因却容易随时间的延长而发生丢失[26］。在酵母菌中，存在大量的蛋白酶表达，这些蛋白酶有些定位于蛋白分泌途径或作用于蛋白分泌途径，外源蛋白表达后的折叠、糖基化等过程中可能会被错误剪切，直接导致蛋白表达量或活性下降。为了提高病毒载体的生物安全性和转基因的效率，本研究中采用病毒骨架载体及包装载体进行包装和转染，通过对病毒基因组进行调整和修饰来消除致病性基因、保留其感染活性，使之成为具有生物活性的基因载体。与前两个载体质粒相比，包装后的病毒颗粒可以利用其天然的感染性进入细胞，且病毒的感染、整合、转录、表达效率高、宿主涉及范围大，可以感染分裂细胞和非分裂细胞；在结构方面，病毒基因组的结构简单、分子背景简单明了，其稳定性易于改造和制备。因此，我们采用慢病毒进行质粒包装，获得了高滴度的慢病毒载体，收集携带GRP78 基因的病毒上清液后，成功转染了HS578T 和MDA-MB-231 细胞，并获得持续稳定表达的乳腺癌细胞稳转系。

本研究通过同源重组克隆技术构建出pCDHCMV-GRP78-HA-EF1-Puro质粒并选取293FT细胞检测其感染效率，结果表明其可以成功转染293FT细胞，且效果良好。将pCDH-CMV-GRP78-HA-EF1-Puro质粒感染HS578T、MDA-MB-231 后，细胞存活率较高，表明包装的过表达病毒载体转染效率达到实验要求，获得GRP78 蛋白过表达细胞稳转系。因为HA 标签为外源蛋白，所以我们选用WESTERN-Blotting 技术对HA 蛋白进行鉴定，成功检测到GRP78 蛋白在乳腺癌细胞稳转系中的表达，在78 kDa 处出现特异性目的条带，说明外源性GRP78 蛋白在稳转系中成功表达，GRP78 过表达的乳腺癌细胞稳转系构建成功，以便进一步研究GRP78 与乳腺癌细胞HS578T、MDA-MB-231 的相关性。由于HS578T 细胞相较于MDA-MB-231 细胞具有更大的体积，因此更适用于观察蛋白的亚细胞定位。我们采用激光共聚焦显微镜检测GRP78 蛋白的亚细胞定位，发现GRP78 蛋白主要分布在HS578T 细胞细胞质中。

综上所述，本研究成功构建内质网应激蛋白GRP78 过表达的乳腺癌细胞稳转系，并观察到GRP78 主要在细胞质中表达，为进一步揭示GRP78在乳腺癌细胞中的机制建立平台，从而为调控乳腺癌的发生、发展提供方向。