运脾消食方提取工艺放大影响因素研究

林欣荣，高紫薇，束雅春，赵 霞∗，吴 磊∗

（1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029； 2.南京中医药大学，江苏 南京 210029）

中药汤剂是我国应用最早、用量最多、临床应用最广泛的剂型［1］，随着其大规模生产，在提取过程中药材堆积程度显著增加，蒸汽加热代替直火加热，容器体积明显增大，使其质量发生了本质变化，也是其有效性下降、不良反应报道增多的因素之一。中药成分复杂，各药味所含有效成分性质差异较大，若要确保工艺放大后产品一致性，还需对相关参数进行细化研究［2-4］。

中医儿科专家江育仁教授通过对脾胃系统疾病的深入研究和临床实践，提出“脾健不在补贵在运” 的科学观点［5-7］，基于此，总结出运脾消食方［8］，由苍术、白术、焦山楂、炒麦芽、鸡内金、生薏苡仁、炒山药、陈皮、莪术组成，具有运脾开胃、消食助长之功，在治疗小儿厌食脾失健运夹积证中的有效率为93.10%［9］。课题组拟将运脾消食方开发成医疗机构制剂以造福更多患者，根据前期网络药理学结果结合文献［10-15］，确定了儿茶素、阿魏酸、花旗松素、异牡荆素、芸香柚皮苷、白术内酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白术内酯I、柚皮素、橙皮素14 种指标成分。本实验基于《医疗机构煎药室管理规范》 制备运脾消食汤［16-17］，通过HPLC 指纹图谱建立与上述指标成分含量测定来评价容器体积、火候、投料量对该方制备工艺的影响，以期为其生产过程控制与产品质量提升提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695 高效液相色谱仪，配置Waters 2998 二极管阵列检测器 （美国Waters 公司）； AR2140 电子天平［万分之一，奥豪斯仪器（上海） 有限公司］； PL-S60T 数显超声波清洗机（东莞康士洁超声波科技有限公司）； 电陶炉（中山市斯梵莱电器有限公司）； 陶瓷药罐 （容量2 100、2 600、3 100、3 600 mL，江西省康舒陶瓷股份有限公司）； XH-C 旋涡混合器（金坛区西城新瑞仪器厂）； 旋转蒸发仪（瑞士Buchi 公司）。

1.2 试剂与药物 儿茶素（批号110877-202005，纯度95.1%）、阿魏酸（批号110773-201915，纯度99.4%）、花旗松素（批号111816-201102，纯度98.9%）、柚皮苷（批号110722-202116，纯度93.5%）、橙皮苷 （批号110721-202019，纯度95.3%）、白术内酯Ⅱ（批号111976-201501，纯度99.9%）、木犀草素 （批号111520-202107，纯度96.3%）、常春藤皂苷元（批号111733-201205，纯度98.3%）、白术内酯I （批号111975-201501，纯度99.9%） 对照品均购于中国食品药品检定研究院； 异牡荆素（批号220310，纯度98%）、桑色素（批号 220119，纯度 98%）、柚皮素 （ 批号220124，纯度98%）、橙皮素（批号220315，纯度98%） 对照品均购于南京聚康医药化工有限公司；芸香柚皮苷对照品（批号18101010，纯度98%）购于成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯； 其余试剂均为分析纯； 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 方剂制备 依据《医疗机构中药煎药室管理规范》 规定和要求，称取麸炒苍术10 g、麸炒白术10 g、陈皮6 g、焦山楂10 g、炒麦芽10 g、炒鸡内金5 g、生薏苡仁12 g、麸炒山药15 g、醋莪术5 g，加入水，用陶瓷罐煎煮2 次，头煎加3.5倍量水浸泡1 h，文火（火候400 W） 煎煮30 min，二煎加2.4 倍量水煎煮20 min，合并煎液，浓缩，定容至200 mL，即得。

2.2 成分含量测定 采用HPLC 法。

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取儿茶素、阿魏酸、花旗松素、异牡荆素、芸香柚皮苷、白术内酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白术内酯I、柚皮素、橙皮素对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并制成质量浓度分别为 0.996、1.201、1.014、1.030、0.548、1.102、1.301、1.000、2.500、1.020、1.004、1.321、1.013、1.010 mg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备 吸取本品5 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件与图谱生成 Luna C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相0.1% 磷酸（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0 ～50 min，95% A；50～100 min，95% ～82%A； 100 ～105 min，82% ～80%A； 105 ～130 min，80% ～70% A）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温40 ℃； 检测波长205 nm； 进样量10 μL，色谱图见图1～2，可知各成分色谱峰均能有效分离。

图1 对照品HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances

图2 15 批运脾消食合剂HPLC 指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints for fifteen batches of Yunpi Xiaoshi Mixture

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012.130723 版），将15 批样品HPLC 指纹图谱与对照指纹图谱进行相似度分析，结果分别为0.996、0.997、0.998、0.995、0.998、0.998、0.999、0.998、0.998、0.996、0.998、0.999、0.997、0.996、0.996，均大于0.995，表明不同批次样品之间相似度较高，所建立的指纹图谱能较全面地反映整体成分情况。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液适量，甲醇逐级稀释成系列质量浓度，在“2.2.3” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.2.5 精密度试验 精密吸取同一份对照品溶液，在“2.2.3” 项色谱条件下进样测定6 次，测得儿茶素、阿魏酸、花旗松素、异牡荆素、芸香柚皮苷、白术内酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白术内酯I、柚皮素、橙皮素峰面积 RSD 分别为 2.8%、2.2%、1.5%、2.6%、2.5%、1.8%、2.7%、2.4%、2.4%、2.5%、2.0%、1.7%、2.3%、2.2%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取“2.2.2” 项下同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.3” 项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得儿茶素、阿魏酸、花旗松素、异牡荆素、芸香柚皮苷、白术内酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白术内酯I、柚皮素、橙皮素峰面积 RSD 分别为 2.0%、2.6%、1.6%、2.9%、1.5%、2.1%、2.5%、2.5%、2.4%、2.7%、1.8%、2.5%、2.9%、2.8%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取同一批本品，按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.3”项色谱条件下进样测定，测得儿茶素、阿魏酸、花旗松素、异牡荆素、芸香柚皮苷、白术内酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白术内酯I、柚皮素、橙皮素含量RSD 分别为2.2%、2.8%、1.9%、0.9%、2.9%、2.6%、1.0%、2.2%、1.5%、2.1%、2.5%、2.7%、2.4%、2.8%，表明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取各成分含量已知的同一批本品6 份，每份10 mL，分别精密加入儿茶素、阿魏酸、花旗松素、异牡荆素、芸香柚皮苷、白术内酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白术内酯I、柚皮素、橙皮素对照品溶液 （质量浓度分别为0.010、0.024、0.101、0.041、0.004、0.011、0.260、0.010、1.250、0.102、0.201、0.005、0.005、0.004 mg/mL） 0.8、0.7、1.0、1.3、0.8、1.0、1.0、1.2、1.1、1.1、1.3、1.1、1.0、0.8 mL （加入量与供试品溶液中相应成分含量的比值约为1 ∶1），甲醇定容至25 mL，按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.3” 项色谱条件下各进样10 μL 测定，计算回收率。结果，儿茶素、阿魏酸、花旗松素、异牡荆素、芸香柚皮苷、白术内酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、木犀草素、常春藤皂苷元、白术内酯I、柚皮素、橙皮素平均加样回收率分别为 99.7%、101.7%、103.3%、99.0%、98.5%、97.7%、97.2%、99.4%、98.4%、96.9%、96.4%、102.6%、102.7%、101.0%，RSD 分别为 2.2%、2.7%、0.5%、1.8%、2.4%、1.2%、0.8%、1.1%、1.2%、1.1%、1.6%、1.8%、2.6%、2.3%。

2.2.9 样品含量测定 取15 批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.3” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果（μg/mL，n＝15）Tab.2 Results for content determination of various constituents （μg/mL，n＝15）

2.3 放大影响因素研究

2.3.1 供试品溶液制备

2.3.1.1 容器体积 称取本品（一日处方量） 9份，分为3 组，分别用2 600、3 100、3 600 mL 陶瓷罐（编号T1、T2、T3） 按“2.1” 项下方法煎煮，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3.1.2 火候 称取本品饮片9 份，分为3 组，按“2.1” 项下方法武火煮沸，文火火候分别控制为500、600、700 W，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3.1.3 投料量 分别称取2、3、4、5、6 倍量（即2、3、4、5、6 副药） 本品饮片各3 份，按“2.1” 项下方法煎煮，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3.2 结果分析 取“2.3.1” 项下供试品溶液适量，在“2.2.3” 项色谱条件下进样测定，以“2.1” 项下煎煮方法所得15 批样品中各成分平均含量为对照（B1），与不同影响因素测定结果置于同一雷达图中，见图3。由此可知，儿茶素、阿魏酸、花旗松素、异牡荆素、芸香柚皮苷、白术内酯Ⅱ、柚皮苷、桑色素、橙皮苷、白术内酯I、柚皮素、橙皮素含量及各成分总含量受火候控制影响较大，木犀草素含量受投料量影响较大，常春藤皂苷元含量受提取容器体积影响较大。

图3 各成分含量雷达图Fig.3 Radar charts for contents of various constituents

再将图3 数据导入SIMCA 14.1 软件进行主成分分析，结果见图4。由此可知，15 批样品与提取容器体积、投料量均在区间内； 不同火候离散程度较大，并且超出95% 置信区间，表明该因素影响程度较大。

图4 不同影响因素主成分分析图Fig.4 Principal component analysis diagram for different influencing factors

3 讨论

本实验建立了15 批运脾消食汤HPLC 指纹图谱，并指认了14 个共有峰，发现相似度均大于0.995，表明其一致性良好，再将不同批次样品中各成分含量的平均值设为对照B1，对容器体积、火候、投料量3 个影响因素进行放大考察。结果，在火候方面，大于700 W 时药液易焦糊，而小于400 W 时煎提效果低，药液难以煮沸，目前大生产中以蒸汽加热代替直火加热，温度上升快，热效率高，但火候较难控制，造成药液总固体含量过高，今后需规范蒸汽加热参数或减少煎煮时间来确保与临床用药的一致性［18］； 在容器体积方面，目前大生产中常用不同体积的多功能提取罐，从罐体上部到底部存在较大的温度梯度，分子热运动速率不同，物质转移速率也不同步，罐体直径越大，上述现象越明显［19］，这也是一些中成药现行质量标准中某些指标要求较高，但实际生产难以达到的原因； 在投料量方面，在2 100 mL 陶瓷罐中投入2 ～6 倍量运脾消食方（若超过6 倍量则加水后容易溢出，影响测定结果），发现随着饮片量增加产生堆积，部分成分在提取液中扩散困难，导致其含量较低［20-21］，目前大生产中投料量并未根据中草药形状和有效成分提取难易度进行区分，而是统一建议不超过设备容积的2/3，如何能与临床用药一致还有待进一步研究。

4 结论

本实验建立运脾消食汤HPLC 指纹图谱，并对该方提取工艺放大影响因素进行考察，发现容器体积、火候、投料量对方中14 种指标成分含量均具有一定影响。上述结果为运脾消食方相关制剂开发与大生产提供了参考依据，今后还需结合药效学实验和临床应用研究来进行更系统全面地验证。