一测多评法同时测定参芪二皮冬茶颗粒中6 种成分的含量

冉铮婷，李 希，∗，冯建安，王 玉，黄 嫣，楼冠华，陈诗韵，王佳佳

（1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137； 2.四川省中医药科学院中医研究所，四川 成都 610031）

参芪二皮冬茶颗粒系四川省第二中医院临床经验方所开发成的颗粒制剂，由黄芪、夏枯草、陈皮等8 味中药组成，具有补气健脾、化痰散结功效，临床上用于肿瘤相关性厌食症［1］、恶病质［2-3］的辅助治疗。方中黄芪特有成分［4］毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有调节免疫［5］、调节肠道菌群［6-7］作用； 夏枯草有效成分迷迭香酸具有抗炎、抑制肿瘤作用［8-10］； 陈皮、青皮中的黄酮类成分具有增强胃肠动力、抗肿瘤作用［11-13］，其中橙皮苷、橘皮素、川陈皮素对胃液量、胃蛋白酶含量及活性共同发挥促进作用［14-15］； 阿魏酸作为当归、陈皮、青皮、山慈菇共有成分，具有抗癌作用［16］，并且与川陈皮素共同发挥抗炎、抗氧化、促胃动力作用［17］。

由于中药复方制剂疗效发挥需多种成分共同作用，故多成分含量测定可为其质量整体控制提供依据［18-19］。一测多评法可在明确内标与其他成分之间相对校正因子的前提下，通过测定前者含量来得到后者含量，具有高效、便捷的优点，故本实验采用该方法同时测定参芪二皮冬茶颗粒中阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陈皮素的含量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 BT-125D 型电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； KQ-300DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； e2998 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； Agilent1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）。

1.2 试剂与药物 橙皮苷（批号110721-202019，纯度95.3%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷 （批号111920-201907，纯度96.1%）、川陈皮素（112055-202001，纯度99.6%）、阿魏酸 （批号110773-201915，纯度99.4%）、迷迭香酸 （批号11871-202007，纯度98.1%）、橘皮素 （批号112054-202001，纯度99.8%） 对照品均由中国食品药品检定研究院提供。参芪二皮冬茶颗粒 （批号20210401、20210402、20210403） 由四川省第二中医医院所提供。黄芪（批号210608）、党参（批号210526）、茯苓 （批号210611）、夏枯草 （批号201229）、陈皮 （批号201012）、当归 （批号220209）、青皮 （批号210122）、山慈菇 （批号210608） 均由四川省中药饮片有限公司提供，经四川省中医药科学院中医研究所谢守德主任中药师鉴定为正品。分析纯甲醇（成都市科龙化学品有限公司）； 色谱纯磷酸（上海凛恩科技发展有限公司）； 色谱纯甲醇、乙腈（美国赛默飞世尔科技公司）； 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橘皮素、川陈皮素对照品适量，甲醇溶解，置于25 mL 量瓶中，制成质量浓度分别为 1.856、0.84、0.748、0.784、0.736 mg/mL的贮备液，分别吸取适量，置于25 mL 量瓶中，加入橙皮苷对照品适量，甲醇稀释溶解，即得（含阿魏酸37.12 μg/mL、毛蕊异黄酮苷葡萄糖苷134.4 μg/mL、迷迭香酸119.68 μg/mL、橘皮素14.72 μg/mL、川陈皮素29.92 μg/mL、橙皮苷884 μg/mL）。

2.1.2 供试品溶液 取研细的本品约2.0 g，精密称定，10 mL 70% 甲醇溶于锥形瓶中，称定质量，超声提取30 min，溶液冷却后加入70%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液 按照处方和工艺，分别制成缺黄芪，缺陈皮和青皮，缺夏枯草，缺当归、陈皮、青皮和山慈菇的阴性样品，按“2.1.2” 项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件 Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0 ～12 min，10% ～13%A； 12 ～40 min，13% ～16% A； 40 ～72 min，16% ～23% A； 72 ～82 min，23% ～45% A； 82 ～97 min，45% ～48% A； 97 ～100 min，48% ～10% A；100～105 min，10%A）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温25 ℃； 检测波长330 nm （0 ～32 min，阿魏酸；60 ～105 min，迷迭香酸、川陈皮素、橘皮素）、260 nm （32～60 min，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷）； 进样量10 μL。

2.3 专属性试验 吸取“2.1” 项下对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，结果见图1，可知，各成分色谱峰分离度理想，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 甲醇稀释“2.1.1” 项下对照品溶液至刻度，制成相应质量浓度，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 取“2.1.1” 项下对照品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样测定6 次，测得阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陈皮素峰面积RSD 分别为0.36%、0.21%、0.11%、0.21%、1.09%、0.60%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取“2.1.2” 项下供试品溶液适量，于0、4、8、12、24 h 在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陈皮素峰面积RSD 分别 0.82%、0.48%、0.63%、0.28%、0.33%、0.27%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一份本品，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陈皮素含量RSD 分别为1.73%、1.07%、0.54%、0.98%、1.61%、1.42%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取各成分含量已知的本品（批号202104111） 9 份，每份约1.0 g，精密称定，分成3 组，每组3 份，分别按高、中、低比例加入对照品，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、迷迭香酸、川陈皮素、橘皮素平均加样回收率分别为100.23%、99.82%、100.32%、100.17%、100.23%、101.18%，RSD 分别为1.94%、2.06%、1.37%、2.25%、1.26%、1.36%。

2.9 相对校正因子计算 参考文献［20-21］ 报道，采用多点校正法，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，以橙皮苷为内标，计算其他5 种成分的相对校正因子fk/s，公式为fk/s＝fk/fs＝ （CkAs） /（CsAk），其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.10 耐用性试验

2.10.1 仪器、色谱柱 取“2.1.1” 项下对照品溶液适量，分别考察Waters e2998、Agilent 1260 色谱仪及Eclise Plus C18、Eclise XDB C18、ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 对各成分相对校正因子的影响，结果见表3，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.10.2 柱温、体积流量 取“2.1.1” 项下对照品溶液适量，分别考察不同柱温、体积流量对相对校正因子的影响，结果见表4～5，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表4 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表5 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.11 色谱峰定位 取“2.1.1” 项下对照品溶液适量，分别在“2.10.1” 项仪器、色谱柱上测定保留时间，计算相对保留时间tRi/s，公式为tRi/s＝tRi/tRs，其中tRi为待测成分保留时间，tRs为内标保留时间，结果见表6，可知均无明显变化（RSD＜5%）。

表6 各成分相对保留时间Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.12 样品含量测定 取3 批样品，按“2.1.2”项下方法制备3 份供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含量，结果见表7，可知2 种方法所得结果接近（RSD＜5%）。

表7 各成分含量测定结果（μg/g，n＝3）Tab.7 Results for content determination of various constituents （μg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本实验先对各成分进行190～400 nm 全波长扫描，发现阿魏酸最大吸收波长为316 nm，迷迭香酸、川陈皮素、橘皮素最大吸收波长均为330 nm，由于橘皮素含量较低，峰面积较小，故选择330 nm 作为上述4 种成分的检测波长； 橙皮苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷分别在283、260 nm 处吸收较大，由于后者在283 nm 处峰高较低，而前者在2 种波长处峰高无明显变化，故选择260 nm 作为上述2 种成分的检测波长。再考察了洗脱系统，结合文献选择0.1%磷酸作为水相，同时分别考察了甲醇、甲醇-乙腈（1 ∶1）、乙腈作为有机相时目标峰与杂质峰的分离情况，发现乙腈可更高效地将两者分开。

3.2 提取溶剂选择 本实验分别考察了50% 甲醇、70%甲醇、80%甲醇、甲醇，发现70%甲醇提取效果最佳，故选择其作为提取溶剂。

3.3 内标选择 由于橙皮苷含量高，性质稳定，无毒，对照品廉价易得，色谱峰峰形最优，故本实验选择其作为内标。

4 结论

本实验采用一测多评法同时测定参芪二皮冬茶颗粒中阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、迷迭香酸、橙皮苷、橘皮素、川陈皮素的含量，该方法简便可靠，可为该制剂质量控制提供参考。