肤痒颗粒中9 种成分含量同时测定及其化学模式识别研究

肖春霞，黄晓婧，许 莉，李婷婷，李 及，赵小勤

（成都市药品检验研究院，国家药品监督管理局中药材质量监测评价重点实验室，四川 成都 610045）

肤痒颗粒由苍耳子（炒、去刺）、地肤子、川芎、红花、白英5 味中药组成，具有祛风活血、除湿止痒功效，用于治疗皮肤搔痒、湿疹、荨麻疹等皮肤病［1］，目前该制剂质量执行标准收录于《中华人民共和国卫生部药品标准（中药成方制剂） 》第六册，但只有性状项、理化鉴别项、制剂通则检查项，无专属性质量控制项目［1］，而局颁标准中的含量测定项也仅涉及阿魏酸或羟基红花黄色素A，难以有效控制其整体质量［2］。本实验选择肤痒颗粒中苍耳子、红花、川芎、白英特征性成分，包括新绿原酸、咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A，采用UHPLC 法测定其含量［3-4］，并进行化学模式识别［5-6］，以期为更全面地控制该制剂质量提供参考。

1 材料

Waters Acquity H class 超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）； XPE26 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，0.001 mg）； AUX220 电子天平（日本岛津公司，0.1 mg）； SK250H 超声仪（上海科导超声仪器有限公司）； 20～200 μL 移液枪（德国Eppendorf 公司）； 超纯水制备系统（美国Millipore 公司）。

绿原酸（纯度96.8%，批号110753-201817）、咖啡酸（纯度99.7%，批号110885-201703）、羟基红花黄色素A （纯度93.1%，批号111637-201810）、阿魏酸 （纯度99.4%，批号110773-201915） 对照品均由中国食品药品检定研究院提供； 新绿原酸对照品 （ 纯度≥98%，批号19042305） 由成都普菲德生物技术有限公司提供；隐绿原酸对照品 （纯度99.1%，批号MUST-20042403） 由成都曼斯特生物科技有限公司提供；洋川芎内酯I （纯度≥98.0%，CAS 号94596-28-8，批号CFS202002）、洋川芎内酯H （纯度≥98.0%，CAS 号94596-27-7，批号CFS202001）、洋川芎内酯A （纯度≥98.0%，CAS 号62006-39-7，批号CFS202002） 对照品均由上海源叶生物科技有限公司提供。

乙腈为色谱纯，购自美国Thermo 公司； 磷酸为色谱纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇为分析纯，购自广东光华科技股份有限公司；水为超纯水。

肤痒颗粒共120 批，来自6 家企业，具体见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Acquity UPLC ® BEH C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流动相乙腈（A） -0.01% 磷酸 （B），梯度洗脱 （0 ～25 min，3% ～4%A； 25 ～30 min，4% ～10%A； 30 ～40 min，10% ～18% A； 40 ～48 min，18% ～30% A； 48 ～55 min，30% ～50% A； 55 ～58 min，50% ～70% A；58～60 min，70%A）； 体积流量0.4 mL/min； 柱温35 ℃； 检测波长0 ～21 min 325 nm，21 ～25 min 390 nm，25～40 min 322 nm，40 ～60 min 278 nm；进样量1 μL。色谱图见图1。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取咖啡酸、洋川芎内酯H 对照品适量，25%甲醇制成每1 mL 分别含两者0.638 6、0.286 5 mg 的溶液，作为对照品溶液①； 精密称取洋川芎内酯I 对照品适量，25%甲醇制成每1 mL 含0.804 5 mg 该成分的溶液，作为对照品溶液②； 精密称取洋川芎内酯A 对照品适量，25%甲醇制成每1 mL 含0.743 6 mg 该成分的溶液，作为对照品溶液③； 精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸对照品适量，置于25 mL 量瓶中，25%甲醇溶解，精密加入对照品溶液①、③各1 mL，对照品溶液②2.5 mL，25%甲醇定容至刻度，即得每1 mL 分别含新绿原酸0.203 9 mg、咖啡酸0.025 5 mg、绿原酸0.384 9 mg、隐绿原酸0.403 5 mg、羟基红花黄色素A 0.621 9 mg、阿魏酸0.095 9 mg、洋川芎内酯I 0.080 5 mg、洋川芎内酯H 0.011 5 mg、洋川芎内酯A 0.029 7 mg 的贮备液，精密吸取1.25 mL，置于50 mL 量瓶中，25% 甲醇稀释至刻度，即得每1 mL分别含新绿原酸5.097 5 μg、咖啡酸0.637 5 μg、绿原酸9.622 5 μg、隐绿原酸10.087 5 μg、羟基红花黄色素A 15.547 5 μg、阿魏酸2.397 5 μg、洋川芎内酯I 2.012 5 μg、洋川芎内酯H 0.287 5 μg、洋川芎内酯A 0.742 5 μg 的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 参考文献［7-8］ 报道，精密称取本品粉末1.0 g 或0.6 g （低蔗糖） 或0.3 g（无蔗糖），置于锥形瓶中，精密加入25%甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按照处方和工艺，分别制成缺红花，缺川芎，缺苍耳子、川芎和白英的阴性样品，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.1” 项下贮备液适量，25%甲醇稀释成系列质量浓度，分别精密吸取1 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y） 对其进样量（X） 进行回归［6］，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度试验 取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得各成分峰面积RSD 分别为新绿原酸0.83%、咖啡酸2.11%、绿原酸0.70%、隐绿原酸0.93%、羟基红花黄色素A 0.92%、阿魏酸0.88%、洋川芎内酯I 0.71%、洋川芎内酯H 0.67%、洋川芎内酯A 1.81%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 精密称取本品（S1） 1 g，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、4、8、12、20、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各成分峰面积RSD 分别为新绿原酸0.90%、咖啡酸2.35%、绿原酸0.44%、隐绿原酸0.66%、羟基红花黄色素A 0.81%、阿魏酸0.43%、洋川芎内酯I 0.49%、洋川芎内酯H 0.49%、洋川芎内酯A 1.94%，表明溶液在24 h 稳定性良好。

2.3.4 重复性试验 取同一份本品（S1），研细，精密称取6 份，每份1 g，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各成分含量RSD 分别为新绿原酸2.24%、咖啡酸1.58%、绿原酸1.76%、隐绿原酸2.48%、羟基红花黄色素A 2.83%、阿魏酸2.68%、洋川芎内酯I 1.15%、洋川芎内酯H 1.06%、洋川芎内酯A 2.42%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品（S1） 9 份，每份0.5 g，分为3 组，分别精密加入对照品溶液 （每1 mL 含新绿原酸40.78 μg、咖啡酸5.10 μg、绿原酸76.98 μg、隐绿原酸80.70 μg、羟基红花黄色素A 124.38 μg、阿魏酸19.18 μg、洋川芎内酯I 16.10 μg、洋川芎内酯H 2.30 μg、洋川芎内酯A 5.94 μg） 1、2、3 mL，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，新绿原酸、咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A 平均加样回收率分别为97.14%、95.50%、96.80%、96.91%、99.51%、102.25%、94.97%、98.06%、93.89%，RSD 分别为0.85%、1.64%、1.84%、2.38%、2.33%、1.33%、1.75%、1.59%、2.88%。

2.4 样品含量测定 取6 家企业120 批样品，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果Tab.3 Results for content determination of various constituents

然后，以各成分平均含量为指标绘制雷达图［6，9］，见图2。由此可知，企业Q1、Q4、Q6 整体轮廓均较大，表明样品中各成分平均含量较高，其中Q1 轮廓基本呈现一个类圆形，表明产品质量良好； Q3 轮廓明显小于其他企业，表明产品可能存在质量较低的风险； Q5 轮廓呈现一个锐尖角形，阿魏酸含量较高，其余成分含量较低，并且该企业执行标准中收载了阿魏酸，虽然严格保证了该成分质量，但忽略了产品整体质量； 同一成分在不同企业样品中的含量差异很大，例如Q4 样品中羟基红花黄色素A 含量是在Q3 样品中的42 倍，阿魏酸含量仅是在Q5 样品中的1/5。

图2 各成分平均含量雷达图Fig.2 Radar chart for average contents of various constituents

2.5 化学模式识别研究

2.5.1 热图聚类分析 以120 批样品中各成分含量为指标，采用Heml-1.0 软件，选择欧式距离、远邻法进行热图聚类分析［10］，结果见图3。其中，行代表各成分，列代表样品，通过颜色冷暖（红绿深浅） 来显示各成分含量高低。

图3 各成分含量热图聚类分析Fig.3 Heatmap clustering analysis of contents of various constituents

由此可知，企业Q1、Q4、Q6 整体条带颜色偏暖，表明样品中各成分含量较高； Q3 整体条带颜色均偏冷，表明样品中各成分含量较低，与图2 一致； Q1、Q4 样品基本各自聚类，而Q6 样品分散于两者分组中，表明其质量一致性较差； 除Q6外，其余企业样品各自聚为一类，表明其各自质量一致性较好，但不同企业样品质量一致性较差；C6 （阿魏酸） 聚为一类，其他成分聚为一类，表明阿魏酸是区分各样品的主要成分［9］。

2.5.2 主成分分析 以各成分含量为变量，采用SIMCA 14.1 软件对120 批样品进行主成分分析［9，11-13］，发现贡献率最大的2 个主成分累积贡献率超过64%，可较好地体现肤痒颗粒基本特征和主要信息［14］。因此，本实验以上述2 个主成分为坐标轴构建主成分平面，将多元变量通过降维方式投影在二维平面上，观察样品整体分布情况和各变量对样品分布的贡献［14］，结果见图4～5。

图4 主成分分析得分散点图Fig.4 Score scatter plot for principal component analysis

图5 主成分分析载荷图Fig.5 Loading plot for principal component analysis

由此可知，企业Q1 ～Q5 分别出现明显的分类，表明样品质量一致性较好； Q6 分散在Q1、Q4中，表明其质量一致性较差，与图3 一致； C6（阿魏酸） 离原点的距离最远，表明它是不同企业样品质量差异的重要指标［9］。

3 讨论

课题组前期发现，不同企业提供的投料药材红花、川芎主要成分含量差异较大，并且工艺和参数存在较大差异。本实验结果也表明，同一企业生产的不同批次样品之间质量一致性较好，而不同企业生产的存在较大差异，这就需要有关部门强化监管意识，企业采用合格原料药材并严格按照相关标准投料和生产，以期保证药品质量［15］。

中药药效是多种成分的综合效应，作用机制复杂［16］，故活性成分越多，含量越高，药效可能越好。本实验查阅文献［17-21］ 发现，羟基红花黄色素A 来源于红花，阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A 均来源于川芎，新绿原酸、咖啡酸、绿原酸均来源于苍耳子、川芎、白英，隐绿原酸来源于苍耳子、白英。

4 结论

本实验建立UHPLC 法同时测定6 家企业120批肤痒颗粒中新绿原酸、咖啡酸、绿原酸、隐绿原酸、羟基红花黄色素A、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯A 的含量，覆盖了方中80%的药味，具有较强的代表性，并且采用雷达图、热图聚类分析、主成分分析等化学模式识别手段，能较全面地反映该制剂整体质量情况，从而为其质量控制提供可行的技术参考和客观数据。