一测多评法同时测定天麻头风灵胶囊中10 种成分的含量

2024-03-12郭绪生邱学伟吴爱英陈安珍刘红兵卢京光

中成药 2024年2期

郭绪生，邱学伟，李丽，吴爱英，陈安珍，刘红兵，卢京光，3∗

（1.中国海洋大学，山东青岛 266000； 2.海洋中药质量研究与评价重点实验室，山东青岛 266000；3.青岛市食品药品检验研究院，山东青岛 266000）

头痛是临床上常见的主诉症状［1］，2018 年国际头痛学会颁布了第3 版《头痛疾病的国际分类》［2］，将本病分为原发性头痛、继发性头痛、痛性颅神经病变和其他面痛、其他类型头痛。天麻头风灵胶囊由天麻、牛膝、玄参、当归、川芎、野菊花、槲寄生等10 味药材组成，具有滋阴潜阳、祛风、强筋骨功效［3-4］，用于治疗一般头痛、长期手足麻木、慢性腰腿酸痛等症［5］，但关于该制剂质量研究的文献大多是对单一成分天麻素［6-9］或阿魏酸［10-11］的含量测定，导致其整体质量难以综合评价。

一测多评法是由王智民［12］提出的通过测定1种代表性成分（对照品易得、价廉、有效）含量，依据相对校正因子完成对多种成分（对照品难以获得、价格昂贵）含量测定的方法，能有效解决对照品缺乏的问题，节约检测成本，从而完成对中药及其复方制剂所含多成分的质量控制［13-16］。因此，本实验建立一测多评法同时测定天麻头风灵胶囊中天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸的含量，以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 infintiyⅡ高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； LC-2030C 高效液相色谱仪（日本岛津公司）； ME204T 电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； AS10200BT 超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）

1.2 试剂与药物天麻素（批号110807-202010，纯度95.5%）、紫丁香苷（批号111574-201605，纯度95.2%）、阿魏酸（批号110773-201915，纯度99.4%）、蒙花苷（批号111528-201911，纯度98.5%）、哈巴俄苷（批号111730-201709，纯度95.9%）、肉桂酸（批号110786-201604，纯度98.8%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；巴利森苷A （批号FS1625402，纯度99.9%）、巴利森苷B （批号FS1625459，纯度99.7%）、巴利森苷C （批号FS1625455，纯度99.3%）、巴利森苷E （批号FS1625458，纯度99.9%）对照品均购自天津阿尔塔科技有限公司。天麻头风灵胶囊分别来自陕西白云制药有限公司（每粒0.2 g，批号170401、170501、170502、170503、170504）、贵州益佰制药股份有限公司（每粒0.2 g，批号170402、171101、171102、180301、180302、180401、180402）。阴性实验所用中药均由青岛善大天源中药饮片有限公司生产，经青岛市食品药品检验研究院吴爱英主任中药师鉴定为正品。乙腈为色谱纯（德国Merck 公司）；其他试剂均为分析纯；水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 GL Science InertsilTMODS-3 色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0 ～10 min，1.0% ～11.0%A； 10 ～18 min，11.0% ～13.0% A； 18 ～30 min，13.0% ～20.0% A； 30 ～40 min，20.0% ～35.0% A； 40 ～43 min，35.0% A； 43 ～45 min，35.0% ～80.0% A）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长220 nm （0 ～33 min，天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A）、280 nm （33 ～45 min，蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸）［17-21］；进样量5 μL，色谱图见图1。由此可知，各成分色谱峰分离度均大于1.5，理论塔板数均不低于5 500，阴性无干扰。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸对照品适量，70% 甲醇制成质量浓度分别为0.197 0、0.410 4、0.205 2、0.448 8、0.243 8、0.263 6、0.420 0、0.062 24、0.193 8、0.401 2 mg/mL 的贮备液，精密吸取适量，70%甲醇稀释成分别含上述成分37.627、32.799、7.814、35.796、9.684、10.481、50.350、12.261、7.434、1.903 μg/mL 的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液取本品内容物6 粒，混匀，取约1.2 g，精密称定，置于100 mL 锥形瓶中，精密加入70% 甲醇50 mL，称定质量，密塞，超声（功率350 W，频率50 kHz）处理30 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液按处方和工艺，分别制成缺天麻、缺槲寄生、缺当归和川芎、缺野菊花、缺玄参的阴性样品，按 “2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 线性关系考察取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，70% 甲醇稀释成6 个质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验吸取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸峰面积RSD 分别为0.18%、0.12%、0.34%、0.15%、0.93%、0.41%、0.09%、0.22%、0.17%、0.55%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验取同一份本品（批号170401），按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸含量RSD 分别为0.38%、0.76%、0.54%、1.22%、0.83%、0.44%、1.52%、0.60%、0.45%、0.58%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验取同一份本品（批号170401），按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸峰面积RSD 分别为0.14%、1.19%、1.09%、0.40%、1.84%、0.44%、1.19%、0.72%、0.67%、1.36%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 加样回收率试验精密称取各成分含量已知的本品（批号171101） 0.6 g，共6 份，按100%水平精密加入对照品溶液，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、阿魏酸、巴利森苷A、蒙花苷、哈巴俄苷、肉桂酸平均加样回收率分别为 102.23%、100.06%、100.29%、101.16%、98.82%、101.18%、101.25%、99.01%、98.53%、99.60%，RSD 分别为 2.57%、2.59%、1.65%、1.62%、1.42%、1.36%、1.64%、2.52%、2.98%、1.65%。

2.5 相对校正因子计算取对照品溶液适量，在“2.1” 项色谱条件下分别进样1、3、5、8、10 μL测定，以紫丁香苷为内标，计算其他9 种成分的相对校正因子fk/s，公式为fk/s＝fk/fs＝（CkAs） /（CsAk），其中Ck为其他成分含量，Ak为其他成分峰面积，Cs为内标含量，As为内标峰面积，结果见表2。

表2 各成分相对校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.6 耐用性试验

2.6.1 仪器、色谱柱取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，分别考察Agilent 1260 Infintiy Ⅱ、LC-2030C 色谱仪，以及 GL Science InertsilTMODS-3 （150 mm× 4.6 mm，5 μm）、NanoChrom ChromCoreTMC18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱对各成分相对校正因子的影响，结果见表3，可知均无明显影响（RSD＜3.0%）。

表3 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.6.2 体积流量、柱温取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，分别考察不同体积流量（0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min）、柱温（25、28、30、32、35 ℃）对各成分相对校正因子的影响，结果见表4～5，可知均无明显影响（RSD＜2.0%）。

表4 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

表5 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.6.3 色谱峰定位取“2.2.1” 项下对照品溶液适量，分别在“2.6.1” 项仪器、色谱柱上测定保留时间，计算相对保留时间ti/s，结果见表6，可知均无明显变化（RSD＜3.24%）。

表6 各成分相对保留时间Tab.6 Relative retention time of various constituents

2.7 样品含量测定取12 批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含量，并通过SPSS 17.0 软件进行t检验，结果见表7，可知2 种方法所得结果无显著差异（P＞0.05）。

表7 各成分含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab.7 Results for content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择课题组前期分别采用不同试剂（50%甲醇、70%甲醇、甲醇、稀乙醇、乙醇）进行提取，并分别考察了超声、回流提取，以及不同提取时间（20、30、40 min），发现70%甲醇超声提取30 min 时效率最高，而且操作简便，各成分色谱峰良好，故选择其作为供试品溶液制备方法。

3.2 色谱条件选择本实验分别考察了流动相甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸，发现乙腈-0.1%磷酸洗脱时基线噪音小，各成分色谱峰分离度更好。通过全波长扫描发现，天麻素、巴利森苷E、紫丁香苷、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A 在220 nm 处有最大吸收，而阿魏酸在该处也有较强吸收，并且峰形、分离度良好，故选择220 nm 测定上述7 种成分；哈巴俄苷、肉桂酸分别在280、276 nm 处有最大吸收，而蒙花苷在280 nm 处有较强吸收，并且峰形、分离度良好，故选择280 nm 测定上述3 种成分。

3.3 内标选择由于紫丁香苷具有性质稳定、含量高、对照品易得价廉的特点，故本实验选择其作为内标。

3.4 成分分析陕西白云制药有限公司所生产的天麻头风灵胶囊中所有成分均可测得，而贵州益佰制药股份有限公司所生产的缺少部分药味成分，需引起关注。