采前氨基乙氧基乙烯甘氨酸处理对‘黄冠’梨长期冷藏后果实品质和果心褐变的影响

何近刚，冯云霄，程玉豆，关军锋,*

（1.河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所，河北 石家庄 050051；2.河北省植物转基因中心，河北 石家庄 050051）

‘黄冠’梨（Pyrus bretschneideriRehd.cv.Huangguan）是我国主栽的中早熟梨品种之一，因其果形端正、果肉细嫩多汁、品质上乘而深受消费者喜爱，市场上销售期可达12 个月[1]。黄冠梨成熟期一般在每年的7月底至8月上旬，由于采收时气温较高，果实呼吸旺盛，而因市场需求贮藏期较长，因此该品种在低温冷藏过程中易发生果面褐斑和果心褐变现象，极大降低了其商品价值，造成严重经济损失[1-2]。

乙烯是启动和加速果实成熟衰老的重要植物激素[3-4]。氨基乙氧基乙烯甘氨酸（aminoethoxyvinylglycine，AVG）为乙烯抑制剂，能够通过阻断S-腺苷甲硫氨酸向氨基环丙烷羧酸的转化过程而减少乙烯的生成[5]。研究证明，采前喷施AVG可延缓果实成熟衰老[6-7]，延长果实的贮藏时间和货架期。梨采前喷施AVG，可抑制乙烯生成，延长果实贮藏期[8-9]，提高果实品质[10]。采前使用250 mg/L的AVG喷施‘Jersey Mac’苹果，可有效降低果实采后内源乙烯生成、延缓果实软化，并且AVG处理苹果含有更高的可滴定酸含量、总酚含量和抗氧化能力[11]；‘McIntosh’苹果采前喷施AVG，可显著降低落果率，推迟呼吸跃变，延长果实采收期[12]；采前AVG处理‘Cripps Pink’苹果相对于1-甲基环丙烯处理来说，延迟乙烯产生和果实转色效果更为明显[13]；采前AVG处理可使‘金冠’苹果推迟转色，并降低果实贮藏时酯类和醛类挥发性物质含量[14]。桃[6]、油桃[15]采前喷施AVG均可有效降低落果率，降低乙烯生成速率和延缓果实软化。李子采前喷施AVG，可有效维持果实硬度，减少果实乙烯生成，维持果实色泽[16-17]。研究发现，AVG采前处理的猕猴桃果实较对照含有更高的总酚含量和抗氧化能力[18]，而AVG采前处理的苹果[7]和李子在贮藏期总酚含量下降[17]。

果实褐变与组织内酚代谢和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）密切相关[19-21]。绿原酸是梨中的一种初级酚类化合物，被普遍认为是导致PPO催化酶促褐变的关键底物[22-23]，苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）是绿原酸生物合成途径的主要酶[23]。此外，果实褐变还与细胞膜的破裂密切相关，磷脂酶D（phospholipase D，PLD）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）的活性影响着脂膜的完整与正常功能[24-28]。

然而，近年来关于AVG调节梨果贮藏性能，尤其是对于果实内部组织褐变的影响研究较少，关于AVG调节组织褐变的机制尚不清楚。本研究采用采前AVG喷施处理方法，研究了‘黄冠’梨果实长期贮藏后品质变化，并采用实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技术研究果心褐变相关基因表达规律，以阐明AVG调控‘黄冠’梨果心褐变的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料‘黄冠’梨种植于河北省赵县梨果示范基地，树龄20 a生。

AVG（商品名ReTain®）美国Valent生物科学有限责任公司；正己烷（色谱纯）美国赛默飞世尔公司；反转录试剂盒（PrimescriptTMRT reagent Kit）、TB Green™ Premix ExTaqII qPCR试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 仪器与设备

GY-4型硬度计 浙江托普仪器有限公司；PAL-1型手持数字糖度仪 日本ATAGO公司；HITACHI L-2000高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 日本日立科学仪器有限公司；UV-2100型紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；7500定量PCR仪 美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 处理

‘黄冠’梨于采前2 周与1 周分别喷施50、100 mg/L以及200 mg/L的AVG，以喷施清水作为对照，每个处理3 株果树。果实于2016年8月11日采收并当天运回实验室，过夜放置散去田间热。选取8～9 成熟，无机械损伤、无病虫害、大小一致的AVG和对照果实置于温度（0±0.5）℃、相对湿度（90±5）%下冷藏180 d后出库，货架（20±1）℃贮藏7 d。于采收当天（0 d）、冷藏180 d以及货架7 d（（180+7）d）测定果实硬度、可溶性固形物质量分数（soluble solid content，SSC）以及可滴定酸（titratable acid，TA）质量分数，统计果皮褐斑及果心褐变情况后，取果心于液氮中速冻、并在液氮中研磨为粉末后放置于-80 ℃，以备后续分析。

1.3.2 果实硬度、SSC以及TA质量分数测定

硬度采用GY-4型硬度计，沿果实赤道部位相对两点测定果实去皮硬度，单位为kg/cm2；SSC使用PAL-1型手持数字糖度仪测定，单位为%；采用酸碱滴定法测定TA质量分数，以苹果酸计，单位为%。

1.3.3 果皮褐斑指数及果心褐变指数统计

按照果皮褐斑面积占果面总面积比率分为4 级：0级，无褐斑；1级，0%＜褐斑面积≤25%；2级，25%＜褐斑面积≤50%；3级，褐斑面积＞50%。果皮褐斑指数按公式（1）计算[2]：

按照褐变面积占果心总面积比率分为4级：0级，无褐变；1级，0%＜褐变面积≤25%；2级，25%＜褐变面积≤50%；3级，褐变面积＞50%。果心褐变指数按公式（2）计算[20]：

1.3.4 绿原酸、熊果苷及总酚含量的测定

绿原酸和熊果苷含量采用HPLC法测定[29]。称取果心1.0 g，加入6 mL 80%甲醇，20 ℃超声提取15 min，10000×g、20 ℃离心10 min，取上清液过固相C18萃取小柱，以甲醇淋洗，经直径为0.45 μm的滤膜过滤后，进行HPLC检测，单位为mg/g（以鲜质量计）。HPLC条件：HITACHI L-2000 HPLC仪自带的反相Lachrom C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），检测波长280 nm，柱温30 ℃，洗脱程序为A相5%冰醋酸水溶液、B相为水、C相为乙腈（0～6 min，A∶B∶C＝19∶76∶5（V/V，下同）；7～19 min，A∶B∶C＝95∶0∶5；20～24 min，A∶B∶C＝85∶0∶15；25 min，A∶B∶C＝55∶0∶45；26～30 min，A∶B∶C＝15∶0∶85；31 min，A∶B∶C＝15∶0∶85；32 min，A∶B∶C＝19∶76∶5），流速为1.0 mL/min，进样体积为10 μL。

采用福林-酚法测定总酚含量[30]。称取0.3 g果心，加入体积分数为50%乙醇溶液5 mL，室温下超声30 min，4 ℃、10000×g离心10 min，得上清液。取1 mL样液加入3.5 mL蒸馏水，加入0.5 mol/L福林-酚试剂0.5 mL，加入70% Na2CO3溶液 1 mL，混匀，30 ℃避光水浴2 h，760 nm处测定吸光度。根据没食子酸标准曲线计算总酚含量，结果以每克样品中没食子酸含量表示（mg/g，以鲜质量计）。

1.3.5 PPO活力的测定

PPO活力测定参考Cheng Yudou等[30]方法。称取果心冻样1 g，加入3 mL的0.1 mol/L（pH 7.0）磷酸缓冲液（含6%聚乙烯吡咯烷酮），4 ℃、12000×g离心15 min，取上清液用于测定PPO活力。将200 μL酶提取液加入到25 ℃预热反应液中（含25 mmol/L邻苯二酚的磷酸盐缓冲液，pH 6.0），使终体积为4 mL。在420 nm波长下测定OD变化值，以每分钟吸光度增加0.01时为1 个PPO活力单位（U），单位为U/kg（以鲜质量计）。

1.3.6 RNA提取与基因表达分析

采用改良CTAB法[31]提取果心总RNA。总RNA经DNase清除DNA后，用PrimescriptTMRT reagent Kit进行反转录。real-time PCR使用TB Green™ Premix ExTaqII qPCR试剂盒。以PbActin2为内参基因[20]，其余基因参照GenBank上登记序列，使用Primer Premier 5.0软件设计基因引物，所有引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。通过2-ΔΔCt法计算出待测基因相对表达量。

表1 real-time PCR特异性引物序列Table 1 Specific primer sequences used for real-time PCR

1.4 数据处理与分析

每个实验处理设3 个重复，测定时每个重复5 个果实。数据采用Excel 2007和SPSS 18.0数据处理软件进行统计和相关性分析，结果用3 次重复的平均值表示，方差分析采用Duncan法。使用GraphPad Prism 9软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度AVG处理对黄冠梨冷藏和货架品质及果实褐变的影响

如图1A所示，采前喷施不同质量浓度AVG对果实采收硬度无显著影响；冷藏180 d后，各处理果实硬度较采收时显著下降，其中200 mg/L AVG处理果实硬度最大，为5.98 kg/cm2，50 mg/L和100 mg/L处理果实硬度与对照果实无明显差别；经过货架7 d（（180+7）d），果实硬度有所下降，不同质量浓度AVG处理果实硬度无明显差别，其中100 mg/L和200 mg/L AVG处理果实硬度显著高于对照果实，说明质量浓度为200 mg/L的AVG维持‘黄冠’梨果实冷藏和货架硬度效果最好。

图1 采前AVG处理对‘黄冠’梨果实冷藏和货架期硬度（A）、SSC（B）以及TA含量（C）的影响Fig.1 Effect of preharvest AVG treatment on firmness (A),SSC (B) and TA content (C) of ‘Huangguan’ pear during cold storage and shelf-life periods

经180 d贮藏，‘黄冠’梨果实采后SSC呈升高趋势（图1B）。采收时，200 mg/L AVG处理果实SSC最高，而50 mg/L和100 mg/L AVG处理果实与对照SSC无明显差别；冷藏180 d，200 mg/L AVG处理果实SSC显著高于50 mg/L和100 mg/L AVG处理和对照；（180+7）d时，200 mg/L以及100 mg/L AVG处理与对照果实SSC无明显差别，而50 mg/LAVG处理果实SSC最低。

在整个贮藏期间，‘黄冠’梨果实TA含量降低（图1C）。采收时，50 mg/L AVG处理果实TA含量最高，200 mg/L AVG处理和对照果实无明显差别，100 mg/L AVG处理果实TA含量最低；冷藏180 d时，100 mg/L和200 mg/L AVG处理果实TA含量显著高于对照和50 mg/L AVG处理果实；（180+7）d，200 mg/L AVG果实TA含量最高，而50 mg/L和100 mg/L AVG与对照无明显差别。

采前喷施不同质量浓度AVG可有效抑制‘黄冠’梨贮藏期果皮褐斑及果心褐变的发生（图2）。冷藏180 d时，对照果皮褐斑指数最高，不同质量浓度AVG处理果皮褐斑指数均低于对照果实，其中200 mg/L AVG处理的果实褐斑指数最低（图2A）。‘黄冠’梨冷藏180 d时果心发生褐变，不同质量浓度AVG处理果实褐变指数在冷藏180 d和货架期间（（180+7）d）显著低于对照果实，其中200 mg/L AVG处理下果心褐变指数最低（图2B）。

图2 采前AVG处理对‘黄冠’梨冷藏和货架期果皮褐斑指数（A）和果心褐变指数（B）的影响Fig.2 Effect of preharvest AVG treatment on peel browning index (A)and core browning index (B) of ‘Huangguan’ pear during cold storage and shelf-life periods

2.2 AVG处理对‘黄冠’梨果心酚类物质含量及PAL基因表达的影响

‘黄冠’梨果心中含量较高的2 种单酚物质为熊果苷和绿原酸，这两种酚类物质以及总酚在贮藏期含量均升高（图3）。AVG处理对采收时（0 d）和冷藏180 d果心熊果苷和总酚含量无显著影响，（180+7）d时200 mg/L AVG处理果心熊果苷和总酚含量显著高于对照（图3A、C）。然而，从采收时（0 d）到贮藏期（180 d、（180+7）d），200 mg/L AVG处理的果心绿原酸含量均显著高于对照果实（图3B），说明AVG处理对于‘黄冠’梨果心绿原酸含量的影响更为明显。这也说明采前AVG处理对采后生物体内次生代谢物质的合成与降解起到了一定的调控作用。

图3 采前AVG处理对‘黄冠’梨冷藏和货架期果心熊果苷（A）、绿原酸（B）和总酚（C）含量的影响Fig.3 Effect of preharvest AVG treatment on contents of arbutin (A),cholorogenic acid (B) and total phenolics (C) in ‘Huangguan’ pear core during cold storage and shelf-life periods

PbPAL1在整个贮藏期间表达量升高（图4A），（180+7）d时该基因表达量达到峰值，而采前AVG处理显著抑制了PbPAL1在‘黄冠’梨果心中的表达。在冷藏180 d时，PbPAL2达到表达峰值（图4B），200 mg/L AVG处理果心中该基因表达量显著低于对照果实；采收时（0 d）和货架期（（180+7）d）时，AVG处理果实PbPAL2相对表达量与对照无明显差别。

图4 采前AVG处理对‘黄冠’梨冷藏和货架期果心PbPAL1（A）和PbPAL2（B）相对表达量的影响Fig.4 Effect of preharvest AVG treatment on the relative expression levels of PbPAL1 (A) and PbPAL2 (B) in ‘Huangguan’ pear core during cold storage and shelf-life periods

2.3 AVG处理对‘黄冠’梨果心PPO活性及基因表达的影响

与采收时（0 d）相比，‘黄冠’梨冷藏180 d时果心PPO活性变化不大，而货架期PPO活性显著升高（图5）。与对照相比，AVG处理显著降低了‘黄冠’梨果心PPO活性。

图5 采前AVG处理对‘黄冠’梨冷藏和货架期果心PPO活性的影响Fig.5 Effect of preharvest AVG treatment on PPO activity of‘Huangguan’ pear core during cold storage and shelf-life periods

两个PbPPO基因在‘黄冠’梨冷藏期间（180 d）表达量明显升高，而货架期（（180+7）d）表达量降低，采前AVG处理对于这两个基因采收时表达量无明显影响不大，但可有效抑制它们在贮藏期的表达（图6）。

图6 采前AVG处理对‘黄冠’梨冷藏和货架期果心PbPPO1（A）和PbPPO5（B）相对表达量的影响Fig.6 Effect of preharvest AVG treatment on relative expression levels of PbPPO1 (A) and PbPPO5 (B) in ‘Huangguan’ pear core during cold storage and shelf-life periods

2.4 AVG处理对‘黄冠’梨果心LOX和PLD基因表达的影响

180 d时，‘黄冠’梨果心中PbLOX1和PbLOX5表达量达到峰值，货架期表达量随之下降（图7）。采前AVG处理对PbLOX1的表达无明显影响，但可有效抑制PbLOX5在180 d和（180+7）d时的表达。PbPLD4在贮藏期表达量降低，AVG处理显著抑制了采收时（0 d）和冷藏期（180 d）‘黄冠’梨果心PbPLD4的表达，但对货架期（（180+7）d）该基因的表达无明显作用（图8）。

图7 采前AVG处理对‘黄冠’梨冷藏和货架期果心PbLOX1（A）和PbLOX5（B）相对表达量的影响Fig.7 Effect of preharvest AVG treatment on relative expression levels of PbLOX1 (A) and PbLOX5 (B) in ‘Huangguan’ pear core during cold storage and shelf-life periods

图8 采前AVG处理对‘黄冠’梨冷藏和货架期果心PbPLD4相对表达量的影响Fig.8 Effect of preharvest AVG treatment on relative expression level of PbPLD4 in ‘Huangguan’ pear core during cold storage and shelf-life periods

2.5 ‘黄冠’梨果心褐变指数与酚类物质以及相关基因表达量相关性分析

相关性分析结果显示（表2），‘黄冠’梨果心褐变指数与绿原酸含量显著正相关（r＝0.475）、与熊果苷（r＝0.650）以及总酚（r＝0.714）含量极显著正相关；与PPO活性显著正相关（r＝0.502），与PbPAL1（r＝0.775）、PbPAL2（r＝0.786）、PbPPO1（r＝0.827）、PbPPO5（r＝0.806）、PbLOX1（r＝0.655）和PbLOX5（r＝0.813）表达量极显著正相关；与PbPLD4（r＝-0.590）表达量极显著负相关。

表2 ‘黄冠’梨果心褐变指数与酚类物质以及相关基因表达量的相关系数Table 2 Correlation coefficients of core browning index with phenol contents and related gene expression

3 讨论

乙烯在促进果实的成熟、形成特有的色泽和风味具有重要的作用，但同时又引起果实衰老和品质劣变[3-4]。AVG作为一种乙烯生成抑制剂，采前处理果实不仅可以减少落果、延长采收期，还可维持果实贮藏期品质[6-18]。本实验通过在‘黄冠’梨采前喷施不同浓度AVG，延缓了‘黄冠’梨在长期贮藏后硬度的下降、保持了较高的SSC以及TA含量，并可有效抑制果皮褐斑和果心褐变的发生（图2），其中以200 mg/L AVG处理效果最为明显。说明采前喷施AVG对于维持‘黄冠’梨贮藏品质、延缓果实衰老具有良好作用。

研究认为，果实组织酶促褐变的原因之一是细胞的膜系统受到损伤，细胞区隔化被打破，细胞中的酚类物质被PPO氧化为褐色的醌类物质[32-34]。梨果实中绿原酸被认为是PPO酶促褐变的底物之一[19,32]，而‘黄冠’梨果心中含量最高的两种酚类物质为熊果苷和绿原酸[35]。本研究中，200 mg/L AVG处理的‘黄冠’梨果心熊果苷和总酚含量在货架期（（180+7）d）显著高于对照果实（图3A、C）；200 mg/L AVG处理下果心绿原酸含量在整个贮藏期都显著高于对照果实（图3B）。说明酚类物质在‘黄冠’梨果心褐变时作为底物被消耗，而AVG处理在一定程度上减少了酚类物质被氧化。PAL是苯丙氨酸途径的限速酶，也是催化苯丙烷类代谢途径第一步反应的酶[36-37]。本研究中发现PbPAL1、PbPAL2基因相对表达量与果心褐变指数极显著相关（表2），这与Cheng Yudou[20]以及韩艳文[38]等在鸭梨果心褐变中的研究结果一致。

PPO广泛存在于生物体内，能够催化酚类物质氧化形成醌，醌再进一步聚合成黑色素[19]。PPO活性的升高以及PPO基因表达的上调与梨果心褐变密切相关[20-21,30]。在本研究中，AVG显著降低了PPO活性（图5）以及PbPPO1与PbPPO5的转录水平（图6）。特别是PbPPO1和PbPPO5表达量的变化与果心褐变的发生同步（图2B、图6），表明这两个基因可能在‘黄冠’梨果心褐变的引发中起着相对重要的作用。此外，AVG处理果实熊果苷、绿原酸以及总酚含量仅在（180+7）d时均显著高于对照果心（图3）；而果心褐变更加严重的对照果实PPO活性在整个贮藏期间均高于AVG处理果实（图5）。这一结果可能与酚类物质的生物合成和氧化过程的整体效应有关，进一步表明在梨果心褐变过程中PPO可能具有更为重要的作用。

LOX和PLD是两种与细胞膜损伤有关的重要酶，可通过氧化游离的二烯和三烯脂肪酸，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生[24-28]。ROS启动脂质分解以及果实衰老和褐变过程[39-41]。有研究发现，AVG可以通过抑制PLD活性进而减少细胞编程性凋亡[42]。在苹果[43]和桃[44]中发现采前AVG处理可抑制LOX活性。但AVG对于细胞膜损伤在基因水平的调控鲜有报道。在本研究中，采前AVG处理下调了PbLOX5和PbPLD4的表达（图7B、图8），说明AVG处理可以避免膜功能的丧失，并有可能保护膜脂免受氧化损伤。PbLOX5在‘黄冠’梨冷藏时表达量显著升高，与果心褐变变化趋势一致；而PbPLD4在贮藏期表达量下降，说明了PbLOX5是‘黄冠’梨果心褐变过程中与膜损伤相关的关键基因。

总之，采前喷施AVG可维持‘黄冠’梨长期贮藏品质，有效抑制果面褐斑和果心褐变的发生，其中以200 mg/L AVG效果最好。‘黄冠’梨果实在长期贮藏时果心发生褐变，同时熊果苷、绿原酸以及总酚含量增加，PPO活性升高；PbPAL1、PbPAL2、PbPPO1、PbPPO5、PbLOX1以及PbLOX5在冷藏期间表达量升高，货架期表达量随之下降，AVG可显著抑制PbPAL1、PbPAL2、PbPPO1、PbPPO5以及PbLOX5的表达。