皖浙花猪干腌火腿源血糖调节肽的分离纯化、鉴定及量子化学表征

黄晶晶，周迎芹，罗 章，刘振东，程秀峰，谢宁宁,*

（1.安徽省农业科学院农产品加工研究所，安徽 合肥 230001；2.安徽省食品微生物发酵与功能应用工程实验室，安徽 合肥 230031；3.西藏农牧学院食品科学学院，西藏 林芝 860000）

糖尿病是全球最严重的慢性疾病之一，2021年20～79 岁人群的患病率约10.5%（5.366亿 人），支出约9660亿 美元[1]。目前无法治愈糖尿病，常用治疗手段有口服药物、注射胰岛素等，亟需通过饮食预防、干预、调控血糖代谢紊乱。某些食物源活性肽具有维持血糖生理稳态的潜力，其结构简单、活性多样，可持续性、安全性、生物利用度高，免疫原性和毒性低[2]。其中部分肽类可以抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等消化酶活性，阻碍碳水化合物转换化为葡萄糖进入体循环，帮助改善受损的胰岛β细胞功能[3]。这类肽的活性与分子质量、疏水性、氨基酸组成等密切相关，但不是氨基酸活性的简单叠加。而肽分子内的相互作用会影响立体效应和结构，很难获得准确的活性作用位点和电子转移路径，仍未明晰其体内降糖机制[4]。

分子对接、定量构效关系、量子化学等多种生物信息学手段已被用于筛选、设计食源性降糖肽并预测其活性，推动了序列鉴定和产品研发。量子化学方法可以输出非经验性的精确能量参数和几何结构，描述酶活性位点运动和电子转移机制。已从药物设计扩展应用到了食品科学，但是尚不多见活性物质的构效关系研究。目前已通过前线分子轨道分析甲硫氨酸和酪氨酸的抗氧化机制[5]；定位多种肽的活性位点，包括水产源鲜味肽[6-7]，酪蛋白源睡眠增强肽YPVEPF[8]，桑黄抗癌肽[9]，抗氧化肽PMRGGGGYHY[10]，DDDY和DYDD[11]、EAAY[12]、FSEY等[13]；并通过密度泛函理论描述了猪肉源二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）抑制二肽的电子特性，发现疏水性氨基酸（尤其是苯丙氨酸和酪氨酸）的重要作用[14]。然而，尚鲜见α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制肽的量子化学研究。

干腌火腿等猪肉产品是降糖小肽的优秀蛋白来源，其蛋白质经过内源酶和微生物共同作用生成多种肽和游离氨基酸[15]。伊比利亚干腌火腿中具有α-葡萄糖苷酶抑制肽[16]和DPP-IV抑制肽[17]。皖浙花猪是制作火腿的优质品种，原产于安徽黄山地区和浙江淳安县[18]。目前，相关研究集中在遗传资源和养殖，营养价值未被开发。因此，本研究从皖浙花猪干腌火腿中制备降糖小肽，分离纯化并鉴定、筛选序列后，计算量子化学结构/能量参数，探究氨基酸组成、立体构象、前线轨道分布、电荷、键长等对活性的影响，预测活性位点，揭示降糖机理，以期为进一步开发、改造、合成肽类产品，克服产业化挑战奠定理论和科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

皖浙花猪干腌火腿，购自安徽黄山市乌金园养猪专业合作社。随机采样多支后熟期火腿样品，真空包装后于（-18±2）℃储存备用。

对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷、碘、二甲基亚砜上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿卡波糖、α-淀粉酶（≥800 FAU/g）、α-葡萄糖苷酶（≥10 U/mg）美国Sigma-Aldrich公司；胃蛋白酶（≥2500 U/mg）、胰蛋白酶（＞3000 U/mg）上海麦克林生化科技有限公司；盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、碳酸钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；马铃薯淀粉 晋城市古陵山食品有限公司；蛋白定量/浓度测定（二奎啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA））试剂盒 大连美仑生物技术有限公司；Sephadex G-25凝胶填料 美国GE Healthcare公司；ODS-AQ-HG填料 日本YMC公司；合成肽 合肥科生景肽生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Y55-40M高速分散乳化仪 上海约迪机械设备有限公司；H1750R离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；N1300旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；FD-1A-50真空冷冻干燥机 上海继谱电子科技有限公司；Infinite E PLEX酶标仪 瑞士Tecan公司；PHS-3CB型pH计 上海越平科学仪器有限公司；HL-2D恒流泵、HD-5电脑紫外检测仪、BSZ-100自动部分收集器上海沪西分析仪器厂有限公司；HC-0210-10中压层析柱15 mm×100 cm 上海华美实验仪器厂；RP-C18柱（0.15 mm×150 mm）美国Column技术公司；Mastersizer 2000激光粒度仪 英国Malvern公司；Easy nLC耦合Q Exactive质谱仪 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 多肽的提取

体外模拟胃肠消化：参考Wang Wenli等[19]的方法并修改。在均质机中加入100 g搅碎的火腿肌肉和400 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.0）中，4 ℃、10000 r/min均质30 s/次，共循环8 次。调节pH值至2.0，添加质量分数2.5%的胃蛋白酶，37 ℃搅拌消化2 h后调节pH值至7.0灭酶。向胃产物中添加胰蛋白酶至最终质量分数为4%，37 ℃搅拌消化2 h后在95 ℃加热5 min灭酶。加入300 mL无水乙醇，4 ℃静置12 h沉淀未消化蛋白质。在4 ℃、10000×g离心20 min，取上清液进行旋蒸，冻干样品并冷冻保存。

水溶提取法：参考Mora等[17]的方法并修改。在均质机中加入100 g搅碎的火腿肌肉和400 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，4 ℃、10000 r/min均质8 min，所得匀浆4 ℃、12000×g离心20 min，玻璃棉过滤后取液体。添加3 倍体积无水乙醇，4 ℃静置20 h沉淀蛋白质。将样品在上述条件下再次离心，取上清液进行旋蒸，冻干样品并冷冻保存。

1.3.2 消化率、提取率和可溶性肽含量测定

消化率是被消化的蛋白质占总蛋白质的比例。用BCA蛋白定量试剂盒检测样品消化前后的蛋白质含量[19]，按式（1）计算消化率：

式中：W0和WD分别为样品消化前和消化后的蛋白质含量。

肽提取率是提取产物中蛋白质量与所用原料初始质量的比值，按式（2）计算[20]：

可溶性肽含量用于衡量可溶解的蛋白质占初始样品的质量百分比，是各组分溶液中的蛋白质量浓度与配制时样品质量浓度的比值，可溶性肽质量分数按式（3）计算：

式中：ρ1为各组分溶液中的蛋白质量浓度/（mg/mL）；ρ0为配制时样品质量浓度/（mg/mL）。

1.3.3 葡聚糖凝胶分离纯化

将多肽样品复溶于超纯水中，制备成200 mg/mL溶液，通过0.45 μm水系膜过滤。取1.5 mL滤液上样于Sephadex G-25凝胶的中压层析柱（15 mm×100 cm）。以去离子水洗脱，流速1.0 mL/min，每管收集2.0 mL，检测波长220 nm。采用HD-A色谱处理系统记录图谱，同时收集各组分[21]。

1.3.4α-淀粉酶抑制活性测定

参考Hľasová等[22]的方法并修改。将100 mg马铃薯淀粉溶解于5 mL PBS（0.1 mol/L，pH 7.0）中煮沸5 min，冷却至室温作为底物。在96 微孔板中加入溶解于二甲基亚砜的2 μL质量浓度5 mg/mL样品、50 μL底物和30 μL上述PBS，37 ℃孵育5 min。添加20 μL、5 μg/mL的α-淀粉酶溶液，37 ℃孵育15 min。加入50 μL 1 mol/L HCl溶液终止反应。最后加入50 μL 0.01 mol/L碘溶液，测量650 nm波长处吸光度。以阿卡波糖作为阳性对照。α-淀粉酶抑制率计算公式如下：

式中：A1为含有样品、底物、酶的溶液吸光度；A2为含有样品和底物的溶液吸光度；A3为含有底物和酶的溶液吸光度；A4为仅含有底物的溶液吸光度。

1.3.5α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

参照Wang Rongchun等[23]的方法并修改。在96 微孔板中加入25 μL PBS（0.2 mol/L，pH 6.8）、25 μL质量浓度1 mg/mL的对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷溶液和25 μL、10 mg/mL样品，混合后37 ℃孵育5 min。随后添加缓冲液配制的5 μL浓度0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃孵育30 min。最后添加40 μL浓度1 mol/mL Na2CO3溶液终止反应，立即测量405 nm波长处光密度。以阿卡波糖作为阳性对照。α-葡萄糖苷酶抑制率按式（5）计算：

式中：ODS为样品和酶反应后的光密度；ODA为样品换为等量缓冲液的光密度；ODB为样品和酶都换为等量缓冲液的光密度。

1.3.6 粒度测定

利用Mastersizer 2000激光粒度仪测量上清液粒度[24]。设置如下：非球形颗粒，相对折射率为1.54，吸收率为0.001，密度为1 g/cm3，水作为分散剂。采用湿法检测，取0.1 g的样品分散于2 mL去离子水中，超声处理5 min使悬浮液均匀。随后滴加到样品池内，调至合适的遮光度。分析其平均粒径，测试3 次取平均值。

1.3.7 序列鉴定

参考钟玉旺等[25]的方法。液相色谱条件：A液为0.1%甲酸-水溶液，B液为0.1%甲酸-乙腈水溶液（乙腈为84%）。色谱柱为RP-C18柱（0.15 mm×150 mm），以95%的A液进行平衡，洗脱时间60 min。质谱鉴定：样品经毛细管高效液相色谱分离后进行质谱分析，时长：60 min，扫描范围：m/z300～1800，检测方式：正离子。多肽和多肽碎片的质荷比按照每次全扫描后采集10 个碎片图谱。原始文件用软件MaxQuant 1.5.5.1处理，根据UniProt_cameidae_89471_20201019（包含89471 个序列，于2020年10月19日下载）搜索，得到鉴定及定量分析结果。

1.3.8 序列筛选

利用PeptideRanker程序（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）对序列评分，评分高于0.7为备选序列[26]；利用Expasy-PeptideCutter（https://web.expasy.org/peptide_cutter/）对序列进行虚拟水解；在BIOPEP-UWM数据库（https://biochemia.uwm.edu.pl/）中检索可能存在的降糖序列[27]；利用PepDraw（http://www2.tulane.edu/～biochem/WW/PepDraw/）在线预测序列的等电点、净电荷和疏水性[28]；采用ToxinPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php）和Pepcalc程序（https://pepcalc.com/）分析毒性和水溶性[29]。

1.3.9 量子化学计算

参考Wen Chaoting等[30]的方法，使用Gaussview 5.0软件构建分子结构，在Gaussian 09软件中选择B3LYP/6-31G（d）基组进行全分子几何构型优化，直到振动频率无负值，虚频为零。计算肽分子的能量参数（分子总能量、分子前线轨道分布与能级）和结构参数（原子Mulliken电荷分布、键长）等。

1.3.10 肽的固相合成

采用体外固相法合成筛选出的肽序列，并利用液相色谱和质谱分析其纯度和分子质量，得到纯度＞95.00%、分子质量准确的肽组分。

1.4 统计分析

使用Microsoft Excel、SPSS Statistics 26.0和Origin 2018进行数据处理与分析；所有实验重复3 次，结果表示为。

2 结果与分析

2.1 多肽消化率、提取率和可溶性肽含量

牛血清白蛋白标准曲线方程为y＝0.2478x+0.0095（R2＝0.9981），线性良好。根据样品的吸光度，换算得到样品的蛋白质量浓度/（mg/mL）。计算出胃蛋白酶对多肽的消化率为（46.41±1.23）%，再经胰蛋白酶消化后显著增加至（79.11±1.85）%（P＜0.05），类似1～3 a成熟期中国干腌火腿（金华、如高和宣威）的体外消化率[19]。如表1所示，水溶法对肽的提取率为（3.81±0.07）%，符合已有研究[20]。而胃胰酶消化法的肽提取率是水溶法的10 倍以上，其产物的可溶性肽含量也显著较高（P＜0.05）。可见胃胰酶消化法的提取效率更高。

表1 两种方法的肽提取率及产物的可溶性肽含量Table 1 Extraction rates of peptides and soluble peptide contents of the water extract and the gastropancreatic digest of dry-cured ham

2.2 葡聚糖凝胶分离纯化结果

葡聚糖凝胶常用于对干腌火腿中不同分子质量的肽进行分级。图1a是胃胰酶消化产物的葡聚糖凝胶Sephadex G-25分离图谱，总洗脱时间为170 min，主要分为WY-I（40～90 min）、WY-II（95～125 min）和WY-III（125～160 min）3 个组分。图1b是水提物的分离图谱，总洗脱时间为220 min，主要分为S-I（50～140 min）和S-II（140～220 min）2 个组分。根据分离原理，出峰越晚，分子质量越小，各组分的分子质量依次为：WY-I＞WY-II＞WY-III和S-1＞S-II。西式干腌火腿小肽有类似的分离图谱，活性最高组分中所含肽的分子质量为400～2500 Da[17]。

图1 胃胰酶消化产物（a）和水提物（b）的Sephadex G-25分离图谱Fig.1 Sephadex G-25 gel filtration chromatograms of the gastropancreatic digest (a) and the aqueous extract (b)

如图2所示，各组分均对两种酶表现了一定的抑制活性，而胃胰酶消化产物及组分的活性远高于水溶提取肽及组分。可能是由于酶对蛋白的切割作用。α-淀粉酶抑制率排序为：WY-I＞WY-II＞WY＞WY-III＞S-II＞S-I＞S，而α-葡萄糖苷酶抑制率为：WY-II＞WY＞WY-I＞S-II＞WY-III＞S＞S-I。降糖活性肽大多为小分子[31]，且只有WY-II组分的两种抑制率均高于60%，分别为（66.66±1.2）%和（68.28±2.73）%，因此选择它进行后续研究。

图2 胃胰酶消化产物和水提物及其分离组分的α-淀粉酶抑制率和α-葡萄糖苷酶抑制率Fig.2 α-Amylase and α-glucosidase inhibitory activities of the gastropancreatic digest and the aqueous extract as well as their separated fractions

2.3 粒径分析

颗粒大小反映了蛋白质经过消化或均质后的降解程度，影响其体内吸收能力。表2为火腿肌肉粗蛋白、两种提取物及其分离组分上清液的粒径。分离前，粗蛋白的D4,3和D3,2均最大。分离后不同组分的粒径存在显著差异（P＜0.05）。消化肽的3 个组分中WY-I的粒径最大，而WY-II和WY-III的D4,3和D3,2无显著差异，说明二者的粒径分布相对相似。水溶物两个组分S-I和S-II的粒径均显著大于消化肽组分。说明火腿肌肉经过蛋白酶降解，颗粒尺寸显著减小，符合现有研究[19,24]。

表2 胃胰酶消化产物和水提物及其分离组分的粒径Table 2 Particle sizes of the gastropancreatic digest and the aqueous extract as well as their separated fractions μm

2.4 序列鉴定和筛选

鉴定高活性组分WY-II中的小肽，获得了104 条长度8～24 个氨基酸的序列。主要蛋白来源有平滑肌肌动蛋白α2、肌球蛋白-4、I型胶原蛋白α1链、肌酸激酶、肌球蛋白轻链1等。利用多种生物信息学工具进行筛选，获得了5 条PeptideRanker评分高于0.7的备选序列，长度9～14 肽，分子质量854～1252 Da。小分子肽活性高可能是与酶活性中心残基形成了氢键。而氨基酸性质和排列也有重要影响，尤其是疏水性。表3中序列含有大量疏水性脯氨酸（N端第二位及中间），N端存在甘氨酸，C端含有碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）。序列包含支链氨基酸[32]，N端的甘氨酸[33]和亮氨酸[34]，或PP、GP等特定二肽[33]更易结合α-淀粉酶。此外，含有疏水性亮氨酸、脯氨酸[23]，以及胰蛋白酶水解后末端具有精氨酸或赖氨酸的肽都会抑制α-葡萄糖苷酶[35]。肽的等电点和静电荷与活性之间具有强相关性[14]，5 条序列的理论等电点为9.80～11.13，净电荷为1，疏水性为13.37～16.00 kcal/mol，均无毒性，其中4 条水溶性良好。因此，筛选这5 条序列进行量子化学计算。

表3 组分WY-II中的肽序列及其理化性质Table 3 Physicochemical properties of peptide sequences in WY-II

2.5 分子构型优化

图3为量子化学优化后5 条备选序列的分子构型。序列的长度较长，增加了形成分子内氢键的可能性，也有利于形成在蛋白质二级结构中占主导的α-螺旋。螺旋结构的稳定性是多种综合性质（构象熵、空间位阻、疏水性和静电性等）平衡的结果，其中氢键网络具有重要作用[36]。5 条序列均具有脯氨酸，其侧链的吡咯环结构具有特殊构象刚性，分子结构出现明显转角。P2、P3的空间结构较为收缩，P3分子形状卷曲复杂，可能是脯氨酸出现次数多，分子内相互作用力较大。除P3外均含有精氨酸，其中P2精氨酸侧链胍基与N2位脯氨酸吡咯环相互作用，促使结构更为紧凑。P4和P5空间结构较为伸展，可能因为分子内相互作用力较小。

图3 5 条血糖调节肽的最优空间构象Fig.3 Optimal spatial conformations of five blood glucose-regulating peptides

2.6 前线分子轨道分布

分子前线轨道理论认为分子轨道是分子体系的波函数，分子里也存在活跃的“前线分子轨道”，即能量最高的电子占有轨道（highest occupied molecular orbital，HOMO）和能量最低的电子未占轨道（lowest unoccupied molecular orbital，LUMO），分别表示供电子和接收电子区域。化学反应只和前线分子轨道有关，且HOMO轨道具有特殊地位[37]。

图4是5 条序列的前线分子轨道分布，这些位点与酶的反应活性可能有显著差异。P1～P5分别有687、651、1119、914、834 条分子轨道及能级。其中，P1、P2和P5的HOMO轨道都主要分布在精氨酸的胍基上。胍基释放出活泼氢后，存在超共轭及共轭现象，结构稳定。P3的HOMO轨道主要分布在C端赖氨酸的侧链，P4的HOMO轨道主要分布在N端亮氨酸。而P1的LUMO轨道主要分布在C4位甘氨酸残基、C3位脯氨酸、C2位精氨酸的肽键，P2～P5的LUMO轨道都分布在C端氨基酸的羧基。可见，氨基酸和种类和不同排列都会影响HOMO的分布[11]，HOMO轨道多分布在精氨酸的胍基及靠近氨基端的活性基团，而LUMO轨道则主要分布在末端羧基及靠近羧基端的基团。

图4 5 条血糖调节肽的前线分子轨道分布Fig.4 HOMO and LUMO orbit distribution of five blood glucoseregulating peptides

分子总能量越小，结构越稳定[38]。表4中5 条序列的总能量排序：P1＞P2＞P5＞P4＞P3。最高占有轨道能级值（EHOMO）和最低未占有轨道能级（ELUMO）分别反应分子的供电子和接受电子能力。EHOMO越大供电子能力越强，易发生亲核反应[39]。表4中EHOMO排序：P3＞P2＞P5＞P4＞P1，说明P3和P2供电子能力较强。而ELUMO越低接受电子能力越强，ELUMO排序为：P2＜P4＜P1＜P5＜P3。ELUMO与EHOMO的差值ΔEL-H表示电子从基础态跃迁到激发态所需的能量。能级差越小，π-电子从低能区到高能区的激发增加，分子反应活性越强；而能级差越大则分子刚性更强、更稳定，电子跌迁能力越弱[40]。由表4可见，ΔEL-H值随着EHOMO的增加有下降的趋势，与Kęska等[14]研究相似。其排序是：P2＜P4＜P3＜P5＜P1，故P2、P4、P3的活性可能相对较高。

表4 5 条血糖调节肽的偶极矩、总能量和前线分子轨道能量Fig.4 Dipole moment,total energy,and molecular orbital energy of five blood glucose-regulating peptides

2.7 电荷分布、键长与活性位点

降糖肽分子的电荷分布和键长对活性有重要影响，主要在前线分子轨道中能级相近的位置上与受体分子发生相互作用。活性部位最有可能是对前线轨道贡献较大的原子，如HOMO轨道。由库仑公式可知：两原子之间的静电荷差值越小，或距离越远（键长越长），则库伦作用力越小，键越弱，越易断裂，血糖调节能力越强。

5 条序列的电荷分布规律相似，负电荷主要分布在N和O原子上，正电荷主要分布在与H及与O相连的C原子上（数值未列出）。由图4和表5可知，P1的HOMO主要分布在精氨酸的胍基，是反应活性部位所在。在97～114号原子之间，静电荷差值最小的两原子是C100（-0.2443 e）与H103（0.1431 e）、C104（-0.1015 e）与H105（0.1285 e），对应键长为C100H103（1.5384 Å）和C104H105（1.3609 Å），根据库仑定律计算得C104H105两原子间的库仑作用力最小，因此，P1活性位点位于精氨酸的C104H105。同理可证，P2～P5的活性位点分别位于精氨酸的C106H108、赖氨酸的C176H177、亮氨酸的C10H12、精氨酸胍基的C35H37。可见，5 条序列的活性位点都位于C—H键。这与抗氧化肽的结果有所不同。四肽DYDD和DDDY的活性位点都位于O58-H59和N10-H12[11]，且肽的活性也可能来自多种不同活性位点[10]。

表5 P1序列GPAGPQGPRG的Mulliken电荷分布及键长Table 5 Mulliken charge distribution and bond length of sequence P1-GPAGPQGPRG

2.8 活性验证

为验证推断的准确性，采用固相法合成上述5 条肽序列，再实测其体外α-淀粉酶抑制率和α-葡萄糖苷酶抑制率。如表6所示，两种降糖活性的排序依次为：P2＞P4＞P3＞P5＞P1和P2＞P3＞P4＞P5＞P1。综合分析量子化学参数及体外活性，发现活性与前线轨道能级差ΔEL-H有较明显的相关性，可能因为ΔEL-H越小，电子的跃迁能力越强，分子在化学反应中的活性越强。针对抗氧化肽的研究也有类似结论[41]。

表6 5 条肽序列的α-淀粉酶抑制率和α-葡萄糖苷酶抑制率Table 6 α-Amylase and α-glucosidase inhibition rates of five synthetic peptides

3 结论

从皖浙花猪干腌火腿胃胰酶消化产物的高降糖活性组分中鉴定出104 条肽，筛选出5 条备选序列，量子化学计算发现HOMO轨道多分布在精氨酸的胍基及靠近氨基端的活性集团上，而LUMO轨道则多分布在末端羧基及靠近羧基端的基团上；能级差较小、活性可能较高的序列为GPMGPSGPR、LGFGGPSGPNAGR、APAPAPAPAPAPPK；根据电荷分布和键长推测5 条序列的活性位点都位于C—H键；体外活性验证了降糖活性可能与能级差有关。下一步考虑利用体外模型验证序列的活性与位点。