纳米Cu/多糖复合抗菌膜的制备与表征及其对冬枣黑斑病的防治效果

徐 悦，陈海艺，周梦含，刘艺璇，郭红莲,*

（1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；2.天津市食品质量与健康重点实验室，天津 300457）

果蔬采后疾病主要是由真菌感染引起，其产生的真菌毒素对人畜均有害，并且由微生物感染果实受损情况占果蔬损失总数的2%～8%，其果实受损率高达50%，因此果蔬采后疾病成为急迫解决的问题之一[1-2]。冬枣（Ziziphus jujubaMill.cv.Dongzao）易受链格孢菌侵染引起冬枣黑斑病，导致枣果产量和质量大幅度下降，这给我国枣产业的生产和贮藏造成了巨大的经济损失[3]。因此，新型高效抗真菌材料的研究开发技术迫在眉睫。

纳米材料因其高反应性和高效率而受到科学家们的广泛关注。如Ag[4]、ZnO[5]、TiO2[6]和SiO2[7]能有效改善材料的物理化学和功能特性，广泛应用于医疗、生物、食品、化工等领域。然而纳米Cu与其他纳米材料相比，具有纳米粒径小、比表面积大、价格低廉和良好的热稳定性等优点[8]，对食源性病原体具有强大生物杀灭作用，能够抵抗恶劣加工条件，是食品包装中使用的最优无机纳米颗粒之一[9-10]。Shankar等[11]将CuO纳米粒子与不同的碳水化合物混合制备多功能生物纳米复合薄膜，探究不同基质对纳米薄膜的影响。Saravanakumar等[12]成功制备纤维素纳米晶须-海藻酸钠-CuO包埋聚合物膜，对病原菌具有较高的抑菌活性以及抗氧化性。大量研究[13-14]表明纳米Cu在抗菌应用时会释放Cu2+，可使细胞产生活性氧，并发生脂质过氧化、蛋白质氧化以及DNA降解，进而导致生物量生长受阻。因此存在纳米材料从包装中迁移至食品的可能性。姜紫薇[15]实验测得Cu2+质量浓度达到4.5 μg/mL时，对人体的肝细胞开始具有损伤作用。Khan等[16]研究发现纳米纤维还原法制备的聚乙烯醇/Cu纳米复合材料中Cu2+的释放量为4 μg/mL。甲壳类水蚤与扁虱是预测污染物对生态系统毒性的良好模型，Heinlaan等[17]实验测得纳米CuO对两者半致死浓度分别为3.2、2.1 μg/mL。因此要有效监控纳米复合膜中离子的迁移量。

可食用的薄膜具有生物降解性、相容性、无毒性、可再生性以及优良成膜能力，是食品包装研究的大趋势[18]。Shankar等[11]实验发现海藻酸钠与纳米铜具有良好的兼容性。并且与明胶复配能够有效提高海藻酸钠单一薄膜的力学性能、热稳定性和生物活性等[19]。利用明胶成本低廉、易获取且有效改善单一薄膜的性能优势，将其与海藻酸钠复配可制备可降解薄膜。另外，海藻酸钠/明胶复合膜除了可以作为分散纳米材料的基质外，还可成为纳米粒子的还原剂和稳定剂[20]，因此海藻酸钠/明胶复合膜可作为纳米Cu粒子的优良载体。

近年来抗菌食品包装膜的研发引起众多研究者们的广泛关注，而对抗真菌食品包装膜的研究甚少。因此，本研究通过绿色方法合成纳米Cu，并以明胶/海藻酸钠为模板制备纳米Cu/多糖复合膜。对纳米Cu以及纳米Cu/多糖复合膜进行结构表征及理化性能的测定，探究复合膜抗真菌活性，将其应用到冬枣黑斑病防治中，并测定防治处理后薄膜Cu2+迁移量。研究结论可为进一步在果蔬病害防治领域利用纳米Cu以及制备高效抗真菌多糖复合膜提供理论基础和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冬枣（Ziziphus jujubaMill.cv.Dongzao）来自天津滨海新区农贸市场。

链格孢菌（Alternaria alternata）、镰刀菌（Fusarium）、灰霉（Botrytis cinerea）由实验室从冬枣中提取；马铃薯葡萄糖培养基（potato dextrose agar，PDA）、硫酸铜、甘油、二水柠檬酸钠、VC、氢氧化钠 天津东天正精细化学试剂厂；海藻酸钠（分析纯，黏度350～550 Pa·s，相对分子质量222.00）、明胶（胶强度～250 g Bloom）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

FEI-Apreo型场发射扫描电子显微镜（field emission scanning electron microscope，FE-SEM）美国捷克公司；IS50型傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy，FT-IR）仪 美国尼高利公司；Q50型热重分析（thermogravimetric analysis，TGA）仪美国TA Instruments Waters LLC公司；UV-3600 Plus型紫外-可见近红外分光光谱（diffuse reflection spectroscopy，DRS）仪 日本岛津公司；ICAPQ型电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICPMS）仪 美国Perkin Elmer公司；TA.TOUCH型质构仪上海保圣实业发展有限公司；CH1S 型数字测微计苏天瑞仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纳米Cu制备

根据Pariona等[21]方法，称取2.5 g的二水柠檬酸钠溶于100 mL的蒸馏水中，加入5 g的硫酸铜，然后加入50 mL的抗坏血酸（0.2 mol/L）充分溶解，加入30 mL的NaOH（1 mol/L）在95 ℃加热90 min。冷却至室温，离心（4000×g、4 ℃）10 min后得到红棕色粉末，为纳米Cu。然后用蒸馏水洗涤3 次，用乙醇洗涤1 次。所得粉末在室温下干燥48 h。

1.3.2 纳米Cu/多糖复合膜的制备

明胶溶液（8%）与海藻酸钠溶液（2%）以质量比6∶4混合均匀，然后添加1.5%（以前面混合溶液质量计）甘油混合成基础膜液。将纳米Cu粉末加入基础膜液中，使其质量浓度最终为0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L，使用搅拌器中速搅拌1 h，然后采用延流法[22]，将15 mL的纳米膜液倒入直径为90 mm的圆形平皿中，45 ℃干燥5 h，冷却至室温揭膜，在相对湿度（55±2）%环境中平衡72 h备用。

1.3.3 复合膜的表征

1.3.3.1 微观结构测定

随机选取完整、表面无划痕的纳米薄膜，切割制成为5 mm×5 mm的正方形，喷金处理后，放置在FE-SEM下进行观察。

1.3.3.2 红外光谱、热稳定性测定

使用FT-IR仪测量薄膜红外光谱以评估薄膜的结构。光谱分辨率为2 cm-1，范围为450～4000 cm-1。

使用TGA仪评估薄膜的热稳定性能，将制备的材料在惰性气体（N2）环境中以10 ℃/min的加热速率从30 ℃加热到600 ℃。

1.3.3.3 透光性测定

使用DRS仪测定膜的透光率。

1.3.4 复合膜理化检测指标测定

1.3.4.1 厚度使用数字测微计在薄膜样品上随机选取10 个位置，测量膜的厚度。

1.3.4.2 水蒸气透过率（water vapor permeability，WVP）参照李雪[23]的方法测量。首先，在称重瓶中注入蒸馏水（100%相对湿度），并覆盖上制备的薄膜。然后将称量瓶放在干燥器中（75%相对湿度、25 ℃），每24 h对称量瓶的质量进行一次称质量。通过式（1）得到WVP：

式中：Δm为称量瓶在Δt时间内的质量变化/g；Δt为测量时间间隔/d；A为薄膜的有效面积/m2；x为薄膜的平均厚度/m；Δp为薄膜两边的水蒸气分压差/Pa（纯水25 ℃时的饱和水蒸气压为3.1671 kPa，75%相对湿度水蒸气压为2.3753 kPa）。

1.3.4.3 吸湿性与含水量

参照李雪[23]的方法，对膜吸湿前后和干燥前后进行质量变化的测定，进而计算出吸湿性和含水量。

1.3.4.4 机械性能测定

使用质构仪对薄膜样品（20 mm×60 mm的长方形）进行拉伸强度（tensile strength，TS）和断裂伸长率（elongation break，EB）的测定。初始抓取分离距离为30 mm，十字头速率为1mm/s。TS和EB分别通过式（2）、（3）得到：

式中：F为薄膜破裂时的最大拉力/N；L为薄膜的宽度/mm；d为薄膜的厚度/mm。

式中：L0为薄膜的原始长度/mm；L1为薄膜断裂时的长度/mm。

1.3.5 纳米Cu/多糖复合膜抗真菌活性的测定

1.3.5.1 复合膜液对真菌菌丝的影响

使用药平板方法测定纳米材料对真菌菌丝的抑制效果。分别吸取1 mL质量浓度为0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L的纳米Cu/多糖复合膜液涂布PDA表面，待含药平板干燥后，向平板中央分别接入链格孢菌、镰刀孢菌、灰霉菌片，共设置3 组不同种抗菌实验，每组3 个平行，实验重复3 次。于27 ℃放置7 d，并进行记录与观察。

1.3.5.2 复合膜液对真菌生物量的影响

分别吸取10 mL质量浓度为0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L的纳米Cu/多糖复合膜液加入90 mL的PDB培养基中，然后向液体培养基中分别接入一个链格孢菌、镰刀孢菌、灰霉菌片，共设置3 组不同种抗菌实验，每组3 个平行，实验重复3 次。于27 ℃放置7 d，离心得到菌丝体，烘干直至质量无变化，观察锥形瓶中真菌生物量生长状况及称量菌丝体的质量。

1.3.6 纳米Cu/多糖复合膜对感染真菌冬枣的防治

1.3.6.1 菌悬液的制备

用接种环刮去平板上的链格孢菌，转移到无菌水中，加入玻璃珠，彻底摇匀溶液。溶液经6 层无菌纱布过滤，得到链格孢子悬浮液。使用血球计数板调整孢子悬浮液浓度至1×105spores/mL，现用现制备。

1.3.6.2 纳米Cu/多糖复合膜对有伤接种冬枣的防治效果测定

首先对冬枣进行预处理，用清水浸泡2 min，流水冲洗2 min，晾干备用。用无菌接种环在赤道位置打小孔直径为2 mm（尽量减小果实创伤），注入浓度为1×105spores/mL的链格孢菌悬液10 μL。待菌液吸收后将基础膜、纳米Cu/多糖复合膜紧贴于果实表面进行包裹，以覆盖膜的为实验组，无膜处理的为对照组（感染无处理组），只进行微小打孔的为空白组（自然组）。每种防治方式处理30 个果实，并设置3 个平行，实验重复3 次。将冬枣置于在室温下、相对湿度85%的泡沫箱中，避光存放，每天观察记录发病情况、测量病斑直径，并根据式（4）、（5）计算发病率及防治效果：

1.3.7 纳米Cu/多糖复合膜中Cu2+向果实迁移量的测定

1.3.7.1 Cu系列标准溶液配制

精确移取1000 μg/mL Cu标准溶液5 mL，用质量分数5%的HNO3溶液定容至100 mL容量瓶中，制得Cu标准储备液（50 μg/mL）。分别移取一定量的Cu标准储备液于50 mL容量瓶中，用5% HNO3溶液定容得到Cu系列标准溶液。

1.3.7.2 样品处理方法

使用ICP-MS仪评估食品复合膜中Cu2+的迁移量[24]，用来进行风险评估。取1.3.6.2节中贮藏期间（5 d和10 d）冬枣果实，将揭膜后不清洗的和揭膜后经3 min流水清洗过的第5、10天冬枣设置为实验组，共4 组，感染无处理组为空白对照组。对待测样品进行烘干粉碎，准确称取0.5 g样品至50 mL消解容器中，加入5%硝酸5 mL、双氧水1 mL，放入石墨加热板150 ℃消解90 min，中途不间断加上述酸至样品消解完全，赶酸，冷却后过滤，定容至10 mL容量瓶中，同法做3 次平行，上机测试。

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 纳米Cu/多糖复合膜的微观结构分析

用FE-SEM对纳米Cu及纳米Cu/多糖复合膜的形貌进行表征。如图1A所示，合成的纳米Cu粒子为规则的球形，大小均一，粒径约44 nm。从图1B可以看出，基础膜表面光滑紧致、连续无孔隙，说明明胶与海藻酸钠结合良好。图1C为0.25 g/L质量浓度纳米Cu/多糖复合膜，显示复合膜的表面相比基础膜稍有粗糙，而纳米Cu粒子在膜中均匀而不连续地分散，与多糖膜液具有良好相容性，略微出现团聚现象。图1D中为高质量浓度纳米复合膜，团聚程度显著加重。说明纳米Cu在薄膜中团聚现象会随着质量浓度递增而加重。以上结果表明适量质量浓度的纳米Cu的加入不会导致薄膜表面出现不均匀的裂纹，所以明胶/海藻酸膜可作为纳米Cu粒子的优良载体。

图1 纳米Cu/多糖复合膜的微观结构Fig.1 Microstructure of nano-Cu/polysaccharide composite films

2.2 纳米Cu/多糖复合膜红外光谱与热稳定性分析

红外光谱分析是研究膜物质结构的有效手段，通过观测吸收峰的变化，可分析纳米Cu与基础膜分子间的相互作用。如图2A所示，3042～3600 cm-1之间存在一个宽频带，这与自由—OH基团的分子内和分子间拉伸或与氢键有关。在2930 cm-1处的特征峰与葡萄糖环中甲基氢原子的C—H拉伸有关。在1630 cm-1处的峰是由水分子的—OH拉伸引起。在1540 cm-1处的峰是由羧基的不对称伸缩振动引起。在1185～1011 cm-1处的条带归因于C—O、C—C、O—H和C—O—C糖苷键的拉伸和弯曲。然而发现随着纳米Cu质量浓度的增加，并没有出现的新的峰，说明纳米Cu只是吸附在基础膜液中，没有化学结构的改变。但是在相同波长下，掺有纳米Cu的多糖复合膜吸收峰的强度增强，推测纳米Cu的加入加强了明胶与海藻酸钠之间的相互作用力，导致膜结构更加紧密，更具有韧性[25]。

图2 不同质量浓度纳米Cu/多糖复合膜的红外光谱与TGA曲线Fig.2 FT-IR spectra and TGA curves of composite films with different concentrations of nano-Cu

在热分解实验中，用TGA仪对复合膜热稳定性进行评价。从膜的热重曲线图（图2B）可以看出，在100 ℃的降解过程中，质量损失是由于水分的蒸发造成的，由图2C可知，基础膜（0.00 g/L）与含纳米Cu的复合膜在100 ℃内发生水分蒸发，这与表1中含水量的测定结果相似，且不同质量浓度薄膜之间存在略微差异。在100～300 ℃之间膜发生显著热分解，在0.00、0.10、0.25、0.50 g/L的膜热分解最高峰温度在165～182 ℃之间，0.75 g/L膜趋于182～227 ℃之间，而1.00 g/L膜的热分解最高峰温度在227 ℃，说明纳米Cu的加入使基础膜热分解向更高温度转移。推测纳米Cu与基础膜之间存在更高的键能，这与FT-IR分析结果一致。综上所述，纳米Cu的加入略微降低了基础膜的热分解行为，这对包装材料的高温灭菌具有重要意义。

表1 复合膜的厚度、WVP、吸湿性、含水量及机械性能Table 1 Thickness,water vapor permeability,hygroscopicity,moisture content and mechanical properties of composite films

2.3 膜的透光性分析

薄膜的透光性影响消费者对食品的感官评价，使用DRS仪对不同水平的纳米Cu/多糖膜的透光性进行表征，结果如图3所示。基础膜具有较高的透明度，掺有纳米Cu材料的复合膜呈现淡绿色，随纳米Cu含量的增加，膜的颜色逐渐加深，所以复合膜的透明度逐渐降低。图3B为不同质量浓度纳米Cu/多糖复合膜的透光率，基础薄膜在可见光下透过率最高，0.75 g/L与1.00 g/L膜的透光性大体一致。总体随着纳米Cu添加量的增加，透光率呈降低状态，这与复合膜的外观形态表述一致。

图3 不同质量浓度纳米Cu/多糖复合膜的外观（A）与透光率（B）Fig.3 Appearance (A) and transmittance (B) of composite films with different concentrations of nano-Cu

2.4 纳米Cu/多糖复合膜的理化性能分析

薄膜的厚度直接影响膜的理化、光学性能，并对膜的TS、EB与WVP也有直接影响。如表1所示，基础膜与复合膜厚度差异显著（P＜0.05），而随着纳米Cu质量浓度的增加，多糖复合膜厚度随之增加，存在略微差异。

WVP是水通过可食用薄膜的质量转移机制。具有较低WVP的薄膜有助于减少或避免食物与外界环境之间的水分交换，防止食品变质[26]。如表1所示，掺有纳米Cu的多糖膜的WVP显著低于基础膜（P＜0.05），1.00 g/L的膜WVP最低（5.5394×10-5g·m/（m2·Pa·d））。推测纳米Cu材料加入到多糖膜网络空间结构中，减少了膜内空间结构的自由体积，增强了基质中的分子间相互作用[27]。因此复合膜形成致密结构，减少了水蒸气的透过性。还有研究[28]发现，小分子基质的掺入为水分子通过聚合物屏障创造复杂的途径。所以纳米Cu的加入显著降低了基础薄膜的WVP。

膜的吸湿性越大，其阻隔性越低[23]。复合膜的吸湿性结果见表1，基础膜的吸湿性最大（（38.8211±0.8112）%），阻隔性能最差。而1.00 g/L 的纳米C u/多糖复合膜的吸湿性最小（（28.2573±0.8163）%），与基础膜相比降低了10.56%，表现出最好的阻隔性能。所以随着纳米Cu的添加量增加，膜的吸湿性逐渐降低，说明纳米Cu的加入显著降低膜的吸湿性（P＜0.05）。已知纳米Cu含量越高，复合膜的WVP越低，推测是由于纳米Cu粒子占据多糖膜网络空间孔隙结构。由此可知，随着纳米材料的增加，含水量亦逐渐降低，这与表1描述一致。

食品包装膜具有可拉伸特征，利于保持膜的完整性和机械强度，能够承受食品加工、处理和储存过程中的外部压力[29]。利用质构仪对复合膜进行了薄膜机械性能的测定。如表1所示，0.50 g/L至1.00 g/L的膜TS远大于0.00、0.10 g/L和0.25 g/L膜。说明纳米Cu的加入显著提高基础膜的TS，降低EB。推测纳米Cu填充多糖复合膜网络结构，增强基础膜与纳米Cu之间的界面相互作用，导致复合膜结构紧密，增强了TS，机械性能优异。

2.5 纳米Cu/多糖复合膜的抗真菌活性

2.5.1 纳米Cu/多糖复合膜液对真菌的抑制活性

抑菌食品包装膜的研究近年来成为广泛重点关注问题，而抗真菌食品包装膜一方面可作为防止真菌入侵的坚固物理屏障，另一方面也是抗真菌的抑菌剂，延长果蔬保质期。本实验使用琼脂平板扩散法探究纳米Cu/多糖膜液对不同真菌的抑菌活性。探究不同质量浓度（0.00、0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L）纳米Cu/多糖复合膜材料在PDA板上对链格孢菌、镰刀孢菌及灰霉的菌丝体的抑制作用，结果如图4A所示。不同质量浓度的纳米Cu/多糖复合膜材料对不同真菌表现出不同程度的抗真菌活性，如图4B所示，纳米Cu/多糖复合膜对链格孢菌、镰刀孢菌及灰霉的抑制率与纳米Cu质量浓度呈正比，在0.10 g/L时对镰刀孢菌（10.93%）与灰霉（12.90%）的抑制效果相似，对链格孢菌的抑制效果最显著，可达32.69%。在0.25、0.50 g/L时复合膜液对镰刀孢菌的抑制性能较低，而在0.75 g/L时抑菌活性上升。纳米Cu/多糖复合膜对链格孢菌、镰刀孢菌及灰霉最高抑菌率分别为87.80%、77.73%、81.96%，因此抑制效果为链格孢菌＞灰霉＞镰刀孢菌。

图4 不同质量浓度纳米Cu/多糖复合膜对真菌抑制效果Fig.4 Antifungal effects of composite films with different concentrations of nano-Cu

2.5.2 纳米Cu/多糖复合膜液对真菌生物量的影响

基于不同质量浓度的纳米Cu/多糖复合膜对不同真菌菌丝生长抑制的比较并不意味着最佳的抗真菌能力，因此要考虑生物量等综合因素。图5显示在未加入纳米材料的膜液（0.00 g/L）中，链格孢菌的生长繁殖能力远大于镰刀孢菌及灰霉，而在相同浓度纳米材料下，对镰刀孢菌和灰霉的抑制效果更佳，这与表2所示抑菌效果相似。在相同真菌条件下，质量浓度与真菌生物量呈反比，说明质量浓度越高，对真菌菌丝体、孢子以及真菌毒素的抑制作用越强。并且纳米Cu质量浓度为0.25 g/L时，对链格孢菌抑制率为55.80%，可称为该真菌的半抑制浓度。但是据图4可知，在相同质量浓度的纳米材料下，链格孢菌的菌丝菌落直径远小于镰刀孢菌、灰霉，而在图5中显示链格孢菌的生物量远大于镰刀孢菌、灰霉。因此可推测纳米Cu对不同真菌产孢量影响存在差异，对产孢量抑制效果为镰刀孢菌＞灰霉＞链格孢菌。综上结果，推测纳米Cu具有破坏真菌细胞膜结构的作用[30]，对真菌生物量起着抑制生长作用，根据表2可知，纳米Cu对真菌生物量的抑制效率为镰刀孢菌＞灰霉＞链格孢菌。

表2 纳米Cu/多糖复合膜对真菌生物量的影响Table 2 Effect of nano-Cu/polysaccharide composite films on fungal biomass

图5 不同质量浓度纳米Cu/多糖复合膜对真菌生物量作用效果Fig.5 Effects of composite films with different concentrations of nano-Cu on fungal biomass

2.6 纳米Cu/多糖复合膜对感染黑斑病冬枣的防治效果

冬枣的真菌感染防治在贮藏、运输和销售过程中是一项具有挑战性的任务。因此，本研究以冬枣为代表性果实，检测纳米Cu/多糖复合膜的生物防治效果。使用0.25 g/L的纳米复合膜进行果实生物防治。图6A为10 d贮藏期的膜处理有伤接种链格孢菌冬枣的防治效果图，图6B显示，冬枣果实发病率随着贮藏时间的延长均呈上升趋势，纳米Cu/多糖复合膜组发病率显著低于感染无处理组、基础膜组（P＜0.05）。感染无处理组果实在第2天开始发病，而基础膜和复合膜处理的果实均在第4天开始发病。第10天时感染无处理组发病率高达94.44%，而纳米复合膜组仅为44.24%，发病率降低53.16%，两者差异显著（P＜0.05）。图6C、D是贮藏期为10 d防治效果，纳米复合膜组病斑直径显著低于基础膜与感染无处理组（P＜0.05），对果实的防治效果最高达52.53%，说明纳米Cu/多糖复合膜能有效延迟感染真菌果实的发病时间并抑制发病速率及病斑直径扩展范围，延长感染黑斑病冬枣的保质期。

图6 纳米Cu/多糖复合膜对有伤接种冬枣防治效果Fig.6 Control effect of nano-Cu/polysaccharide composite films on black spot disease of winter jujube

2.7 纳米Cu/多糖复合膜中Cu2+向果实的迁移分析

以0.25 g/L纳米Cu/多糖复合膜为研究对象，当复合膜与食品接触时，Cu2+会从膜中向果实迁移，少量的Cu2+进入果实表面或是内部，可以抑制果实中致病菌繁殖，从而延长果实保质期。实验测得Cu标准曲线为Y＝1177.71X+24.33，决定系数R2为0.9998，说明该方法的线性相关性高，满足样品检测要求。如图7所示，冬枣在0 d时Cu含量为0.9581 mg/kg，在5 d未清洗时为1.2471 mg/kg，清洗后可去除0.0388 mg/kg，Cu2+迁移量为0.2890 mg/kg（0.0145 μg/mL）。在10 d未清洗时Cu含量为1.3321 mg/kg，清洗可去除0.0885 mg/kg，Cu2+迁移量为0.3740 mg/kg（0.0187 μg/mL）。发现随时间变化，复合膜中的Cu2+迁移量增加，并且5 d和10 d清洗后的果实中Cu含量差异较小，而对未清洗果实，10 d时的Cu含量显著高于5 d（P＜0.05），说明复合膜中的Cu2+仅存在于果皮表面，不会进入果实内部。姜紫薇[15]实验发现当Cu2+质量浓度达到4.5 μg/mL时，对人体的肝细胞开始具有损伤作用。而纳米Cu/多糖复合膜在10 d时Cu2+迁移量（0.0187 μg/mL）远小于4.5 μg/mL，所以该纳米Cu/多糖复合膜在果蔬包装领域应用存在危害健康风险较低，可放心使用。

图7 纳米Cu/多糖复合膜对冬枣Cu含量的影响Fig.7 Migration of Cu2+ from nano-Cu/polysaccharide composite films to winter jujube

3 结论

本研究通过绿色合成纳米Cu材料，与明胶/海藻酸钠膜液共混制备纳米Cu/多糖复合膜，测定合成的纳米Cu为规则的球形，大小均一，粒径约44 nm。并且纳米Cu粒子的掺入影响膜的外观形态，多糖膜可作为纳米Cu的优良载体。绿色合成纳米Cu的掺入有效降低多糖膜的WVP、吸湿性及含水量，使复合膜具有良好的机械性能。进而探究了纳米Cu/多糖复合膜对链格孢菌、镰刀孢菌、灰霉的最高抗真菌活性分别为87.80%、77.73%、81.96%。使用0.25 g/L的纳米Cu/多糖复合膜对感染黑斑病的冬枣进行10 d的防治，发病率有效降低53.16%，防治效果达52.53%，在10 d时Cu2+迁移量为0.0187 μg/mL。根据以上结果，纳米Cu掺入明胶/海藻酸钠多糖膜可以有效降低感染真菌果实的腐烂率，延长冬枣果实的保质期，可作为一种新型的食品专用抗真菌包装材料。