顶复门原虫多胺合成研究进展

殷熙娟,廖申权,戚南山,李 娟,吕敏娜,蔡海明,胡俊菁,林栩慧,宋勇乐,张健騑,刘文俊,孙铭飞*

(1.仲恺农业工程学院,广东广州 510225;2.广东省农业科学院动物卫生研究所,农业农村部禽流感等家禽重大疫病防控重点实验室,广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心,广东广州 510640)

顶复门原虫是一类专性细胞内寄生原虫,包括疟原虫(Plasmodiumspp.)、弓形虫(Toxoplasmagondii)、隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)及艾美耳球虫(Eimeriaspp.)等。当前寄生原虫病的防治主要依赖抗原虫药物,随着抗原虫药物长期使用,寄生原虫对绝大多数药物出现耐药性,且耐药性问题日益严重,因而,抗原虫药物靶标的研究及新型抑制剂筛选成为研究的热点之一。多胺(polyamines,PAs)是一类含有2个或以上氨基,带正电荷的小分子脂肪族化合物,广泛存在于生物体内,可以与DNA、RNA、蛋白质及含有负电荷基团的磷脂物质结合,参与维持细胞核酸和染色质结构、离子通道调节与蛋白质合成,还可以通过调节翻译起始过程关键调节因子真核起始因子2和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1的磷酸化,以及利用亚精胺作为真核生物翻译起始因子5A的诱导前体来调节翻译起始和延伸[1]。多胺在顶复门原虫生长、发育、繁殖与致病等多个阶段发挥重要作用[2]。顶复门原虫的多胺合成途径与宿主细胞的经典路径不同,寄生原虫的多胺生物合成路径存在多样性,具有经典途径和非经典途径[3];并且顶复门原虫多胺代谢限速酶,如鸟氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶等半衰期与宿主细胞限速酶的半衰期存在显著差异[4]。近年来,以顶复门原虫多胺合成限速酶及多胺转运载体为靶标的抗寄生原虫抑制剂研究取得了一定进展。本文就顶复门原虫多胺的生物学功能、生物合成及抗原虫抑制剂研究等进展进行综述。

1 多胺的生物学功能

多胺是一类聚阳离子脂肪族化合物,存在于所有的细胞中,是细胞生长所必需的物质。多胺是由带氨基的碳链组成的小分子,其氨基带正电荷,能够与DNA、RNA、蛋白质及含有负电荷基团的磷脂物质通过离子键和氢键结合。哺乳动物与顶复门原虫细胞内的多胺包括腐胺(putrescine,Put)、亚精胺(spermidine,Spd)和精胺,主要参与细胞的生长、增殖与分化等,在顶复门原虫的生长、发育和繁殖多个阶段发挥重要作用。真核生物多胺合成途径高度保守,通过经典途径合成多胺,该途径的合成底物为鸟氨酸,利用精氨酸酶(arginase,ARG)将L-精氨酸转换为L-鸟氨酸,再通过鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)作用产生腐胺;然后利用S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,AdoMetDC)将S-腺苷甲硫氨酸脱羧,生成脱羧S-腺苷甲硫氨酸(decarboxylated S-adenosylmethionine,dcSAM);将dcSAM作为氨基丙基供体,在亚精胺合成酶(spermidine synthase,SpdS)作用下将腐胺转化为亚精胺;亚精胺经精胺合成酶作用生成精胺[5]。

2 顶复门原虫的多胺生物合成

2.1 疟原虫多胺合成途径

多胺参与疟原虫的发育和繁殖过程,尤其在虫体快速繁殖的裂殖体时期对多胺的需求量增多。研究发现疟原虫体内多胺的含量从环形体到裂殖体升高了10～20倍,并且疟原虫体内多胺主要为亚精胺,其次为腐胺和精胺[6]。疟原虫通过经典途径合成多胺,参与多胺生物合成的酶包括精氨酸酶、鸟氨酸脱羧酶、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶和亚精胺合成酶,研究显示疟原虫缺少精胺合成酶,但亚精胺可以通过亚精胺合成酶作用生成精胺[7]。

2.1.1 疟原虫ODC/AdoMetDC的生物学功能 恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)多胺的生物合成由ODC和AdoMetDC两个限速酶调控,与其他物种不同的是,疟原虫的ODC/AdoMetDC是一种双功能酶,由同一个开放阅读框编码,氨基端的AdoMetDC与羧基端的ODC由一段含274个氨基酸的铰链区相连。PfODC/AdoMetDC由氨基端的AdoMetDC和羧基端的ODC二聚体构成异源四聚体[8]。研究发现,PfODC/AdoMetDC双功能酶的两个结构域各自发挥其生物学功能,抑制PfODC/AdoMetDC双功能酶中ODC结构域的酶活性并不影响AdoMetDC的酶活性,反之亦然。PfODC/AdoMetDC对鸟氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的Km值分别为41 μmol/L和58 μmol/L;鸟氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的酶活性分别为38和20 nmol/min每mg蛋白,PfODC/AdoMetDC对两个底物的催化效率相近,提示可能与疟原虫维持腐胺生成与S-腺苷甲硫氨酸脱羧平衡相关[8]。然而研究显示,宿主细胞ODC对鸟氨酸催化活性达12 800 nmol/min每mg蛋白,较PfODC/AdoMetDC对鸟氨酸的催化活性高[9]。PfODC/AdoMetDC是疟原虫多胺合成的主要调控酶,疟原虫ODC/AdoMetDC调节机制与哺乳动物ODC和AdoMetDC均不同,研究表明,腐胺反馈抑制PfODC的效率是哺乳动物ODC的10倍;二胺可以激活哺乳动物AdoMetDC活性,而对PfAdoMetDC无效。PfODC/AdoMetDC的半衰期为2 h,而宿主细胞ODC和AdoMetDC的半衰期约15～35 min,与疟原虫ODC/AdoMetDC半衰期相比较短[10]。PfODC/AdoMetDC与宿主ODC和AdoMetDC生物学特性存在明显差异,因此,PfODC/AdoMetDC已成为抗疟原虫药物的潜在靶标。

2.1.2 疟原虫ARG的生物学功能 疟原虫精氨酸酶水解L-精氨酸生成L-鸟氨酸和尿素,为Mn2+激活。PfARG由411个氨基酸残基组成,分子质量为46.5 ku,PfARG与人精氨酸酶hARGⅠ和hARGⅡ的相似性分别为28%和27%。PfARG是一种三聚体蛋白,分析发现PfARG存在两段多肽序列的插入,分别是位于L2环由74个氨基酸残基组成的低复杂度区域和L8环的11个氨基酸残基,进一步研究发现,L2环的低复杂度区域偏离三聚体界面,对酶活性影响不显著;而L8环氨基酸残基位于三聚体界面,参与多个分子内和分子间的相互作用,对酶活性至关重要。PfARG对精氨酸的Km值为13 mmol/L,Vmax值为每mg蛋白31 μmol/min[11]。用伯氏疟原虫(P.berghei)arg-基因缺失株子孢子感染小鼠,发现P.berghei在小鼠体内的红细胞外期感染力显著下降[12],提示ARG可作为抗疟原虫红细胞外期感染药物的潜在靶标。

2.1.3 疟原虫SpdS的生物学功能 疟原虫亚精胺合成酶PfSpdS由321个氨基酸残基组成,分子质量为36.6 ku。PfSpdS与人亚精胺合成酶hSpdS的相似性为37.4%[13]。Northern blot和Western blot分析发现,PfSpdS在疟原虫成熟滋养体阶段高表达;间接免疫荧光试验发现PfSpdS定位于虫体细胞质。PfSpdS对腐胺和S-腺苷甲硫氨酸的Km值分别为52.0 μmol/L和35.3 μmol/L。疟原虫缺少精胺合成酶,利用高效液相色谱技术(high performance liquid chromatography,HPLC)发现PfSpdS还具有亚精胺氨基丙基转移酶活性,将亚精胺转化为精胺,PfSpdS对亚精胺的Vmax值为75.3 nmol/min每mg蛋白,该催化效率为PfSpdS对腐胺催化效率的15%,该结果与前期研究并未在疟原虫基因组数据中注释到精胺合成酶,以及在疟原虫体内检测到较低水平精胺的结果相一致;并且在此催化反应中生成的甲硫腺苷是PfSpdS的反馈抑制剂,其对PfSpdS半数抑制浓度(IC50)为159 μmol/L[13]。构建约氏疟原虫(P.yoelii)PySpdS基因缺失株[14],发现PySpdS血红期约氏疟原虫的生存至关重要。近年来研究解析了PfSpdS与底物腐胺、亚精胺,以及与抑制剂AdoDATO、4MCHA等的复合物晶体结构,为以PfSpdS靶标的抑制剂筛选提供试验依据。

2.1.4 疟原虫多胺的转运 疟原虫可以利用从头合成途径合成多胺,并为虫体提供腐胺、亚精胺和精胺等主要的多胺来源,此外,疟原虫还利用转运载体从宿主细胞摄取多胺及多胺合成所需底物。早期研究发现正常红细胞不合成多胺,在红细胞内可检测出亚精胺和精胺[15]。分析诺氏疟原虫(P.knowlesi)腐胺转运载体,发现红细胞感染P.knowlesi后,从发育早期的环形体即可检出腐胺,且呈现时间和温度依赖性的饱和状态。感染细胞与正常细胞的腐胺转运载体对腐胺的亲和力相近,其Km值分别为34.6 μmol/L和37.2 μmol/L;但感染细胞转运载体对腐胺的转运效率更高,感染细胞与正常细胞对腐胺转运的Vmax值分别为11.6和4.21 nmol/min每100亿个红细胞。伯氏疟原虫精氨酸转运载体是一种阳离子氨基酸转运体,在虫体配子生殖时期起着至关重要作用[16]。疟原虫阳离子氨基酸转运体家族蛋白中溶质运载蛋白家族蛋白7可以转运精氨酸、L-赖氨酸和L-鸟氨酸等阳离子氨基酸[17];并且证实肝内期疟原虫主要通过捕获宿主细胞精氨酸,通过精氨酸-ODC/AdoMetDC途径合成虫体发育所需的多胺,提示精氨酸转运载体蛋白家族蛋白7在虫体肝细胞内的发育期起着重要作用,可以作为抗疟原虫药物的潜在靶标。

2.2 弓形虫多胺合成途径

弓形虫缺少精氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶,不能用精氨酸从头合成虫体所需的多胺[18]。弓形虫用逆转途径生成亚精胺和腐胺,参与该逆转途径的酶包括亚精胺/精胺N1乙酰基转移酶、亚精胺N1乙酰基转移酶(spermidine N1-acetyltransferase,SAT)和多胺氧化酶(polyamine oxidase,PAO)[3]。弓形虫以精胺为底物,利用Tg乙酰基转移酶或TgPAO将精胺转化为亚精胺;再通过TgSAT或TgPAO将亚精胺转换为腐胺。Tg乙酰基转移酶对精胺的Km值为180 mmol/L,酶活性为1.84 nmol/min每mg蛋白;TgSAT对亚精胺的Km值为240 mmol/L,酶活性为3.95 nmol/min每mg蛋白;TgPAO对乙酰精胺的Km值为36 mmol/L,酶活性为10.6 nmol/min每mg蛋白。HPLC技术分析发现,弓形虫体内主要的多胺成分为亚精胺,其次为腐胺和精胺[19]。

研究发现,弓形虫存在腐胺、精氨酸和鸟氨酸转运载体,可以从宿主细胞摄取腐胺、精氨酸和鸟氨酸,其中腐胺转运载体对腐胺的亲和力高,其Km值为0.9 μmol/L[20]。弓形虫精氨酸转运载体TgNTP1存在12个跨膜结构域,分子质量约58 ku,TgNTP1对精氨酸的Km值为88 μmol/L,Vmax为3.5 pmol/min每个卵囊。TgNTP1对精氨酸的转运作用不依赖Na+、Cl-、K+、Mg2+或Ca2+等离子,但对pH敏感,当pH>8时,TgNTP1对精氨酸的转运效率显著下降。同时,研究表明TgNTP1在弓形虫发育及致病过程中起着重要作用[21],是抗弓形虫药物研发的潜在靶标之一。

2.3 其他顶复门原虫多胺合成途径

微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)多胺合成途径与植物及部分细菌利用途径相近,通过非经典途径合成多胺,参与该途径的酶包括精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase,ADC),鲱精胺亚胺水解酶(agmatine iminohydrolase,AIH)、亚精胺/精胺N1乙酰基转移酶和亚精胺N1乙酰基转移酶(SAT)。研究发现隐孢子虫缺失ODC,利用CpADC起始多胺合成,CpADC将精氨酸脱羧生成鲱精胺,再通过CpAIH作用生成腐胺;隐孢子虫也可以利用Cp乙酰基转移酶通过逆转途径生成亚精胺,亚精胺经CpSAT作用生成腐胺。CpADC是隐孢子虫多胺合成途径的限速酶,分子质量为106 ku,最适反应pH值为6.7,对精氨酸的Km值为200 μmol/L,Vmax值为325 pmol/h每mg蛋白;隐孢子虫乙酰基转移酶对精胺的Km值为50 μmol/L,Vmax值为7 970 pmol/h每mg蛋白,SAT亚精胺的Km值为130 μmol/L,Vmax值为1 044 pmol/h每mg蛋白。隐孢子虫也具有AdoMetDC酶活性,作用生成的S-腺苷甲硫氨酸为虫体亚精胺和精胺合成提供氨基丙基供体,其Vmax值为331 pmol/h每mg蛋白。研究显示,隐孢子虫体内多胺成分以亚精胺为主,其次为鸟氨酸、鲱精胺、精胺、精氨酸和腐胺。

艾美耳球虫多胺代谢途径研究进展较少,柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)具有ODC、AdoMetDC酶活性,其中EtODC对鸟氨酸的Vmax值为17 pmol/h每mg蛋白,EtAdoMetDC对S-腺苷甲硫氨酸的Vmax值为252 pmol/h每mg蛋白。EtAdoMetDC酶活性可以被Mg2+激活,腐胺对其酶活性无影响;然而CpAdoMetDC酶活性可以被腐胺激活,Mg2+对其酶活性无影响,两者的生物学特性存在明显差异。HPLC分析E.tenella虫体内多胺成分以精氨酸为主,其次为鸟氨酸和少量的腐胺、亚精胺和精胺。

顶复门原虫多胺合成途径呈现多样性,疟原虫具有从头合成途径,弓形虫主要利用转运摄取或逆转途径合成多胺,隐孢子虫利用与植物、细菌等更相近的途径合成多胺,艾美耳球虫可能存在从头合成多胺途径,但目前研究较少[3]。这些研究结果提示,顶复门原虫多胺合成方式的多样化可能与虫体多样化的寄生部位相关,如微小隐孢子虫主要寄生于小肠上皮细胞的刷状缘纳虫空泡内,并非完全寄生于宿主细胞胞质内,推测虫体可能依赖从肠腔摄取多胺合成底物,如摄取宿主肠腔富含的精氨酸等进行多胺合成。多胺在顶复门原虫生存、发育、繁殖及致病过程中发挥着重要作用,以顶复门原虫多胺合成途径限速酶或转运载体为潜在靶标的研究受到较多关注。

3 顶复门原虫多胺合成的应用研究

以顶复门原虫多胺合成途径限速酶(ODC、AdoMetDC、ADC、SpdS),以及多胺转运载体为潜在靶点的抑制剂研究较为广泛(表1)。早期研究发现二氟甲基鸟氨酸(DL-α- difluoromethylornithine,DFMO)是ODC的不可逆抑制剂,DFMO最初被研发作为抗癌药,随后用于抗由布氏冈比亚锥虫(Trypanosomabruceigambiense)所引起的非洲昏睡病;研究显示DFMO对PfODC的亲和力低,Ki值为87 600 μmol/L;对体外P.falciparum繁殖的IC50值为1 250 μmol/L[22]。DFMO在30 μmol/L时对体外E.tenella繁殖的抑制率达56%,但DFMO在抗疟原虫和抗球虫的作用效果未达到临床应用效果,推测可能与疟原虫和球虫对DFMO吸收效率低相关[3]。随后研发了新的ODC抑制剂3-氨基氧-1-氨基丙烷(3-aminooxy-1-aminopropane,APA) 及其衍生物CGP52622A 和CGP54169A,对体外P.falciparum繁殖的IC50值分别为1.0、2.7、2.0 μmol/L,选择指数分别为12.8、4.5和20.4,其中APA和衍生物CGP54169A对宿主细胞安全性更好[6]。研究发现甲基丙脒腙(methylglyoxal bis guanylhydrazone,MGBG)和MDL73811可以抑制AdoMetDC酶活性,其中MDL73811对PfAdoMetDC的Ki值为1.6 μmol/L,MGBG和MDL73811对体外P.falciparum的IC50值分别为224 μmol/L和3.0 μmol/L;PfAdoMetDC抑制剂CGP40215A和CGP48664A,两种对PfAdoMetDC的Ki值分别为0.8 μmol/L和3.0 μmol/L,对P.falciparum的IC50值分别为1.8 μmol/L和8.8 μmol/L,其中CGP40215A的选择指数值为41.3,而CGP48664A对宿主细胞的IC50值仅为0.18 μmol/L,该衍生物对宿主细胞毒性较大[6]。

表1 顶复门原虫多胺合成与转运抑制剂

二氟甲基精氨酸(α-difluoromethylarginine,DFMA)可以抑制隐孢子虫ADC活性,对体外微小隐孢子虫繁殖的IC50值为30 μmol/L[3];未检测到DFMO对微小隐孢子虫的抑制效果,与微小隐孢子虫缺失DFMO靶标ODC研究结果相一致。环己胺(cyclohexylamine,CHA)、反式-4-甲基环己胺(trans-4- Methylcyclohexylamine,4MCHA)和5-氨基-1-戊烯(5-amino-1-pentene,APE)可以特异性抑制PfSpdS酶活性,其中4MCHA具有较好的抑制效果,对PfSpdS的IC50值为1.4 μmol/L,对体外疟原虫生长抑制的IC50值为34.2 μmol/L[13]。研究也发现1-氨氧基-3-氨基丙烷可以抑制PfSpdS酶活性,其对PfSpdS的IC50值为84 μmol/L,抑制效率较对PfODC的低,推测APA因可以同时抑制PfODC与PfSpdS的酶活性,因而APA具有很好的抗疟原虫生长效果,其抑制虫体生长的IC50值仅为1.0 μmol/L[6]。随后,研究发现N-(3-氨丙基)环己胺(N-(3-aminopropyl)- cyclohexylamine,NAC)、4-甲基苯胺(4-methylaniline,4MAN)、S-腺苷-3-巯基-1,8-二胺基辛烷(S-adenosyl-3-thio-1,8- diaminooctane,AdoDATO)可以特异性抑制PfSpdS酶活性,其中NAC抑制PfSpdS活性的IC50值为7.4 μmol/L[22]。

研究发现多胺类似物可以抑制多胺合成底物转运载体活性,从而抑制顶复门原虫发育和繁殖。二苄基多胺类似物MDL27695可以抑制多胺转运,从而抑制疟原虫生长,MDL27695对疟原虫抑制率IC50值为3 μmol/L。基于MDL27695结构信息合成N,N′-脂肪族二胺系列衍生物,这些化合物可以有效抑制疟原虫和弓形虫转运载体活性,其中化合物4、15、26和27对疟原虫抑制效果明显,其IC50值均低于0.4 μmol/L;化合物13和25对弓形虫抑制效果较好,1 μmol/L浓度化合物13可以抑制75%的弓形虫发育,而1 μmol/L浓度化合物25可以完全抑制弓形虫发育[24]。MDL27695以及N,N′-脂肪族二胺衍生物具有良好的体外抗原虫效果,仍有待于通过动物模型试验进一步评价这些衍生物的抗原虫效果。

4 展望

顶复门原虫的感染可引起疟原虫病、弓形虫病、隐孢子虫病和球虫病等,严重危害人类与动物健康。由于抗原虫药物的长期使用,耐药性问题日益突出,发现新的抗原虫药物靶标并进行抑制剂研发成为抗原虫药物研发的热点。多胺作为一种细胞生长所必需的脂肪族化合物,在顶复门原虫的生长、发育、繁殖和致病等多个阶段发挥重要作用,因而,以顶复门原虫多胺生物合成限速酶为靶点,开展抗原虫药物的研发成为近年来的研究热点。二氟甲基鸟氨酸是多胺生物合成限速酶鸟氨酸脱羧酶的特异性抑制剂,临床上用于治疗由布氏冈比亚锥虫寄生引起的非洲昏睡病。二氟甲基鸟氨酸在抗疟原虫和抗球虫的作用效果并未达到临床应用效果,可能是疟原虫和球虫对二氟甲基鸟氨酸吸收效率低。用计算机辅助虚拟筛选技术,针对顶复门原虫多胺生物合成限速酶鸟氨酸脱羧酶、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶、亚精胺合成酶及多胺转运载体等开展了系统的抑制剂筛选工作,通过体外试验表明部分抑制剂的半数抑制浓度达至纳摩尔级,具有明显的抑制原虫生长、发育的效果。基于药物靶标开展计算机辅助的虚拟筛选技术的应用,加快了抗原虫抑制剂筛选效率,为新型抗原虫药物的研发提供可借鉴的新思路和新技术。后续研究工作将利用动物模型试验进一步评价这些抑制剂在体内的作用效果,阐明多胺合成途径抑制剂的作用效果,为抗原虫新药研发提供理论依据。