林麝解没食子酸链球菌的分离鉴定及药敏试验

李 颖,黄志鑫,张琰杰,李 鹏,李旭鑫,胡清霞,吕 妮,李 超,谢宏林,李 哲,王兴龙*

(1.西北农林科技大学,陕西杨凌 712100;2.片仔癀(漳州)医药有限公司,福建漳州 363000;3.陕西省铜川市新区坡头街道办事处,陕西铜川 727100;4.陕西省铜川市耀州区疫病预防控制中心,陕西铜川 727100)

林麝(forest musk deer)为哺乳纲偶蹄目反刍亚目,是我国一级保护濒危野生动物。公麝有麝香腺能分泌麝香,麝香是四大名贵动物药材之一。疫病是导致林麝死亡的重要原因,其中肺炎引起林麝死亡较多。肺炎是林麝呼吸道的主要疾病[1],铜绿假单胞菌[2]、肺炎克雷伯菌[3]等可以引起林麝肺炎,常见的肺炎症状主要是肺充血、出血、肺气肿和肺部出现大小不等的化脓灶等症状。2021年10月某林麝养殖场连续出现林麝死亡,林麝出现精神沉郁、食欲减退、鼻腔有分泌物、咽部肿胀、呼吸困难等症状。为分析发病原因,对病死林麝剖检,初步判断为细菌性肺炎引起的败血症。为确诊病因,采集病料通过病原菌分离纯化、形态观察、生化试验和16S rRNA序列分析,并进行了药物敏感性试验,为该病的临床用药和养殖管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与病料 昆明小鼠25只,购自科奥华仁生物公司。病料采自陕西省某林麝养殖场,病料样品为2岁发病公麝的各脏器组织。

1.1.2 主要试剂 各种染色试剂、细菌微量生化反应管和抗菌素药敏片,杭州滨和微生物试剂有限公司产品;普通营养培养基、LB营养培养基和绵羊血琼脂培养基,南京诺唯赞生物科技有限公司产品;DNA Marker DL 2 000和2×TaqMasterMix,南京诺赞生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 SHA-X恒温摇床,上海智胜分析仪器制造有限公司产品;SW-CJ-IBU超净工作台,上海博讯实业有限公司产品;TC-5000 PCR仪,Techne有限公司产品;电泳仪,北京六一生物科技有限公司产品。

1.1.4 引物设计与合成 16S rRNA 扩增通用引物序列为LPW-57(5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和LPW-58(5′-AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3′),由西安擎科生物科技股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 对病料进行常规消毒,并观察其病变部分。将病变部位无菌接种在绵阳血平板上,37℃恒温培养24 h后观察菌落颜色及形态。选取典型菌落接种于普通营养琼脂和血平板上分离纯化,37℃恒温培养24 h,挑取单个菌落进行革兰氏染色并镜检,观察菌落形态。

1.2.2 分离菌株生化鉴定 挑取分离菌株培养物分别接种于葡萄糖、乳糖、尿素、V-P反应、棉籽糖、甘露醇、枸橼酸盐、阿拉伯糖、鼠李糖等细菌微量生化反应管中,于37℃培养18～24 h,分析并记录反应结果,结果参照文献判断[4]。

1.2.3 分离菌株PCR鉴定 采用煮沸法提取模板DNA,用16S rRNA PCR通用引物LPW-57和LPW-58进行PCR扩增,目的条带大小为1 300 bp。PCR扩增程序为:94℃ 2 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,35个循环;72℃ 5 min。将PCR产物送到西安擎科生物有限公司进行测序。阳性对照鸭源和牛源解没食子酸链球菌由实验室分离保存。

1.2.4 分离菌株药敏试验 利用药敏纸片法进行药敏试验,挑取纯培养的菌液100 μL,并均匀涂布于普通营养琼脂平板上,用无菌镊子贴上药敏片,置37℃温箱培养18 h,记录抑菌圈直径,抑菌环直径判定依据欧盟药敏试验标准(EUCAST)。

1.2.5 小鼠的致病性试验 挑纯培养的单菌落溶于无菌PBS中制成菌悬液,按倾注平板培养方法进行活菌计数。 将25只小鼠随机分成5个组,每组 5只。第1～4组为试验组,第5组为空白对照组。对试验组小鼠进行腹腔注射菌悬液 0.2 mL/只(含菌量为2×108CFU/mL、2×107CFU/mL、2×106CFU/mL、2×105CFU/mL),对照组小鼠接种相同剂量无菌PBS 0.2 mL/只,各组接种后隔离饲养,每隔12 h观察小鼠临床表现。对各组出现症状及死亡小鼠进行剖检,观察病变无菌分离细菌[5]。

2 结果

2.1 临床表现及剖检病理变化

发病林麝最初出现发热、厌食症状,部分林麝体温可达41℃,随后鼻腔流出黏液性分泌物,呼吸急促、气喘,精神沉郁、食欲废绝、停止反刍;部分发病麝跛行、难以站立;头颈扭曲,出现神经症状(图1A);眼结膜充血。死亡林麝剖检可见肺脏肿大、广泛性出血(图1B),淋巴结、咽部以及胆囊肿大;肝脏肿大边缘钝厚有出血点,其病灶区与胸腔粘连。肾脏和脾脏有出血点,肾脏质感脆。

图 1患病林麝临床症状及剖检肺脏变化

2.2 分离菌株的形态鉴定

将菌株接种于绵羊血琼脂培养基,37℃培养24 h,菌落为灰白色、透明、湿润黏稠,露珠状,周围出现β型溶血环。镜检发现为革兰氏阳性球菌,命名为YL-1(图2)。

A.血平板生长形态; B.革兰染色镜检(1 000×)

2.3 生化鉴定

分离菌在葡萄糖、乳糖、尿素、VP反应、棉籽糖、甘露醇试剂管反应均呈阳性,在枸橼酸盐、阿拉伯糖、鼠李糖试剂管反应均呈阴性(表1)。与解没食子酸链球菌的生化结果一致,因此初步确定分离菌株为解没食子酸链球菌。

表1 分离菌株的生化特性

2.4 分离菌株的16S rRNA PCR分子鉴定

对分离菌株进行16S rRNA PCR检测,PCR扩增产物大小为1 300 bp左右(图3),与预期片段大小一致。将测序结果与NCBI数据库中已有的序列进行Blast对比,与致病性解没食子酸链球菌(GenBank登录号:No-CP054015)相似性达到99%,系统进化分析结果(图4)显示,YL-1与其他分离菌株亲缘关系较远。

M.DNA标准DL 2 000; 1.分离菌株; 2.鸭源解没食子酸链球菌; 3.牛源解没食子酸链球菌; 4.阴性对照

图4 基于16S rRNA基因构建的系统发育树

2.5 药物敏感性试验结果

分离菌对环丙沙星、头孢拉定、氧氟沙星、氯霉素、丁胺卡那、哌拉西林、新霉素、麦迪霉素、新霉素、四环素和红霉素等药物敏感,对苯唑西林、头孢呋辛、多黏菌素B、复方新诺明等有耐药性(表2)。

表2 分离菌的药敏试验结果

2.6 致病性试验结果

25只昆明系小鼠接种菌液后出现精神沉郁、采食活动减少、弓腰、颤抖等临床症状。攻毒1组(2×108CFU/mL)从第4天开始死亡,到第7天小鼠全部死亡;攻毒2组(2×107CFU/mL)从第5天开始逐渐死亡,到第7天小鼠全部死亡(图5);PBS对照组小鼠未出现死亡,精神、食欲正常。从死亡小鼠的肺脏、肝脏和肾脏中能分离到该致病菌(图6),说明分离得到的解没食子酸链球菌具有致病性。

图5 不同菌液浓度下小鼠的生存曲线

A.肺脏; B.肝脏; C.肾脏

3 讨论

分离菌为牛链球菌,牛链球菌包括7个不同的种和亚种,即解没食子酸链球菌解没食子酸亚种、解没食子酸链球菌巴氏亚种、马肠链球菌、解没食子酸链球菌马其顿亚种、婴儿链球菌婴儿亚种、婴儿链球菌结肠亚种和非解乳链球菌[6]。该菌首次在树袋熊的排泄物中分离出[7],在人和多种动物中也分离到该菌[8]。人类感染主要是引起新生儿的败血症、脑膜炎和老年人的败血症、心内膜炎。动物的感染主要是引起多器官的损伤及败血症。由此可见该菌对人和动物影响非常大,目前在我国对该病研究较少,但随相关病例报道数量的增加,应对该菌予以重视。

对病死林麝剖检结果显示,此菌对林麝的肝脏、肺脏等均有不同的损害,且病变明显。由于发病林麝数量较多,且发病时间较集中,呼吸道感染的可能性较大,因此防控该病需要保持圈舍干净、干燥、通风,每天清理粪便等杂物,保持地面清洁。另外,加强饲养管理,做好防冻措施,增强林麝自身抵抗力。林麝解没食子酸链球菌对兽医临床常用抗菌药物表现出较高的耐药性,通过药物敏感性试验选择高效的抗菌药物予以及时治疗,才可能获得理想治疗效果。解没食子酸链球菌主要通过呼吸道方式传播,患病林麝应及时隔离,切断传染源。

分离菌对健康昆明小鼠具有明显的致病性。试验组小鼠接种菌液后12 h开始出现精神沉郁、采食活动减少、弓腰、颤抖等临床症状,直至死亡。剖检可见小鼠肝脏、肺脏有出血点,肺脏肿大,肠壁变薄。本研究从病死林麝分离获得致病性解没食子酸链球菌,并证明了其致病性,分析了其药物敏感性,特别是证明了解没食子酸链球菌可能是林麝肺炎致病病原之一,为相关林麝的疫病防控提供了参考资料。