牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

蒲 鹏,李晨露,张 琪,吴发兴,许信刚*

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100;2.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032)

牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是单股正链RNA病毒,属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。BCoV主要由粪-口、气溶胶和呼吸道飞沫传播,通过呼吸道和胃肠道感染不同年龄牛,导致严重的犊牛腹泻,成年牛冬季下痢[1-2]。成年牛中该病毒与其他呼吸道病原体合并感染,可引起呼吸道疾病[3]。BCoV感染成年牛后虽然病死率较低,但会造成奶牛产奶量和体重显著下降,感染犊牛后会有较高的病死率[4-5]。聚合酶链反应(PCR)技术已普遍应用于病原微生物的核酸检测,荧光定量PCR检测技术是在普通PCR技术上发展而来,其特异性和敏感性更高,而且可对样品进行定量分析[6-7]。近年对牛冠状病毒荧光定量PCR检测研究较少,本试验参照GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因保守序列设计特异性引物和探针,建立一种BCoV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,为其流行病学调查及临场样本检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及样品 牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型由中国动物卫生与流行病学中心国家动物血清库鉴定并保存;用于临床检测的132份粪便样品采集自云南省不同地区奶牛场。

1.1.2 主要试剂 pGM-T载体试剂盒、氨苄青霉素、胶回收试剂盒、病毒DNA基因组提取试剂盒、LB培养基、DNA Marker、快速质粒小提试剂盒、Premix ExTaq(Probe qPCR),天根生化科技有限公司产品;感受态细胞DH5α、2×AccurateTaqMaster Mix,艾科瑞生物工程有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 梯度PCR仪、凝胶成像系统,莫纳生物科技有限公司产品;恒温振荡器,苏州培英实验设备有限公司产品;低温高速离心机,曦玛离心机(扬州)有限公司产品;实时荧光定量PCR仪,西安天隆科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针 根据GenBank收录的BcoV AKS-01株N基因序列(KU886219)选择保守区设计引物, BCoVF:CAATCCAGTAGTAGAGCGT CCT;BCoVR:CTGGTTGCTGAGAAGTGACAG T;BCoV-Probe:FAM-TGCCAAAGACCAGTATGGCACCGA-BHQ1,片段大小为142 bp。

1.2.2 重组质粒的构建 按DNA组提取试剂盒说明书对保存毒株BcoV进行核酸提取,用特异性引物对反转录得到的cDNA模板进行PCR扩增。扩增产物用1%凝胶电泳确定目标基因片段大小与预期相符后,目标片段胶回收产物与pGM-T载体在16℃金属浴中连接16 h并转化至DH5α,转化成功后涂布至Amp+抗性琼脂平板进行筛选,经PCR鉴定为阳性后送至西安热默尔生物有限公司测序,用酶标仪测定浓度计算拷贝数。

1.2.3 反应体系和反应条件的优化 荧光定量PCR反应体系为20 μL,分别以10 μmol/L探针浓度对0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 μL等5个梯度进行优化,以20 μmol/L引物浓度对0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL等6个梯度进行优化,以56～60℃温度梯度进行退火温度的优化。

1.2.4 标准曲线的建立 在荧光定量PCR最佳反应体系和反应条件下,将重组质粒用无DNA/RNA酶水10倍稀释,以5.75×107～5.75×103copies/μL为模板进行扩增,同时设置阴性对照,建立标准曲线。

1.2.5 特异性试验 使用病毒提取试剂盒分别提取BCoV、BRV、IBRV、BVDV、BPIV3基因组核酸,以BCoV、BRV、BVDV、BPIV3反转录后得到的cDNA以及IBRV的基因组DNA为模板在1.2.3中反应体系和反应条件下进行扩增,同时设置阴性对照,评价该方法的特异性。

1.2.6 敏感性试验 在荧光定量PCR最佳反应体系和反应条件下,将重组质粒用无DNA/RNA酶水10倍稀释,以终浓度为5.75×107～5.75×100copies/μL的重组质粒为检测样品较常规PCR扩增进行对比,同时设置阴性对照,评价两种检测方法的敏感性。

1.2.7 重复性试验 在荧光定量PCR最佳反应体系和反应条件下,将重组质粒用无DNA/RNA酶水10倍倍比稀释,以终浓度为5.75×106～5.75×104copies/μL的重组质粒为检测样品进行扩增,每组样品重复3次,评价批内重复性;分别选取3个不同的时间进行扩增,评价批间重复性。

1.2.8 临床样品检测 采用本试验建立检测方法以及常规PCR检测方法对云南省不同地区收集的132份粪便样品进行检测,评价临床应用效果。

2 结果

2.1 重组质粒的构建

将构建的重组质粒送至北京热默尔生物有限公司进行测序,测序结果显示重组质粒序列与预期序列完全一致。计算重组质粒拷贝数为5.75×1010copies/μL。

2.2 反应体系和反应条件优化结果

荧光定量PCR的反应体系为20 μL:Premix ExTaq(Probe qPCR)10 μL,探针(10 μmol/L)及上、下游引物(20 μmol/L)各0.3 μL,模板1 μL,ddH2O补足到20 μL。反应条件为:95℃ 30 s;95℃ 5 s、60℃ 30 s,40个循环。

2.3 标准曲线的建立

将BCoV重组质粒用无DNA/RNA酶水10倍稀释,分别以终浓度为5.75×107～5.75×103copies/μL重组质粒为检测样品进行扩增。结果显示,当重组质粒所制备的标准品终浓度为5.75×107～5.75×103copies/μL时与Ct值线性关系良好,所建立标准曲线回归方程为y=-3.207x+40.749,R2=0.999,E=105%(图1)。

图1 BCoV荧光定量PCR标准曲线

2.4 特异性试验结果

用优化好的反应体系和反应条件分别对BCoV、BRV、IBRV、BVDV、BPIV3进行检测。检测结果显示,BcoV检测结果为阳性(图2),其余均为阴性,表明该方法特异性良好。

1.BCoV扩增曲线;2～5.分别为BRV、IBRV、BVDV和BPIV3扩增曲线;N阴性对照

2.5 敏感性试验结果

将BCoV重组质粒用DEPC水10倍稀释,分别以终浓度为5.75×107～5.75×100copies/μL的重组质粒标准品为待检样品,ddH2O为阴性对照进行扩增。结果显示,以BCoV终浓度为5.75×107～5.75×100copies/μL的重组质粒标准品为检测样本其最低检测限为5.75×101copies/μL(图3);较常规PCR最低检测限为5.75×102copies/μL(图4),说明该方法敏感性较常规PCR高,敏感性良好。

1～8.5.75×107～5.75×100 copies/μL标准模板TaqMan荧光定量PCR扩增曲线;N.阴性对照

M.DNA标准DL 2 000;1～8.5.75×107～5.75×100 copies/μL标准模板常规PCR扩增

2.6 重复性试验结果

将BCoV重组质粒用无DNA/RNA酶水10倍稀释,分别以终浓度为5.75×106～5.75×104copies/μL的重组质粒为模板分别进行批内和批间重复性试验。扩增结果显示,批内和批间重复性试验结果稳定,重复性良好,变异系数均小于2%(表1)。

表1 BCoV荧光定量PCR重复性试验结果

2.7 临床样品检测结果

临床对132份样品检测结果显示,TaqMan荧光定量PCR检测阳性数27份,阳性率为20.45%,常规PCR检测阳性数22份,阳性率为16.67%,两者符合率为96.21%。

3 讨论

牛冠状病毒病呈全球性分布,由牛冠状病毒感染引起的新生犊牛腹泻以及BRDC是阻碍我国养牛业发展的重大因素之一[8]。近年来,随着养牛业的发展,牛冠状病毒的流行给养殖户造成了一定的经济损失。由于引起犊牛腹泻的病原体较多且症状较相似,因此,必须通过实验室检测才可以确诊[9]。目前,牛冠状病毒实验室检测TaqMan荧光定量PCR检测方法相较病毒分离鉴定、HA/HI、ELISA、中和试验、PCR检测等方法来说,荧光定量PCR操作简单,用时较短,其特异性更强,敏感性更高。

牛冠状病毒N基因高度保守,本试验以牛冠状病毒AKS-01株N基因序列为模板,同时比对15条N基因序列,选择其保守序列进行引物和探针的设计,并进行重组质粒的构建,以此来建立BcoVTaqMan荧光定量PCR检测方法,经验证,该方法对BcoV特异性良好,且与BRV、IBRV、BVDV、BPIV3均无交叉反应;较普通PCR检测方法灵敏10倍,最低检测限为5.75×101copies/μL;批内重复性和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。对收集的132份粪便样品进行检测,TaqMan荧光定量PCR检测阳性率为20.45% ,常规PCR检测阳性率为16.67%,两者符合率为96.21%。说明云南省部分地区牛冠状病毒感染率较高。目前尚无针对牛冠状病毒的特效抗病毒药物,因此想要降低该病毒的感染率,首先必须做好预防工作,BCoV对氯仿、乙醚和肥皂等脂溶剂以及某些消毒剂如福尔马林、苯酚等均较为敏感,定期对牛舍进行消毒、通风,及时更换垫料,保持牛舍干燥,以控制该病毒的传播[10-11]。