基于JNK-p62/SQSTM1信号通路探讨糖肾煎对2型糖尿病肾病大鼠足细胞的保护作用

晏玲 胡爱民 张利芳 牛晓静

(武汉市中医医院内分泌代谢病科,湖北 武汉 430014)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者一种常见的微血管并发症,糖尿病患者中约有40%患有慢性肾脏疾病〔1〕。目前,DN已经发展成导致终末期肾病的一种重要因素,如果不能获得及时治疗,可能会造成肾衰竭等后果,严重威胁生命健康〔2〕。然而目前尚无DN的根治方法,主要采取控制血糖的手段来进行遏制〔3〕,但不能很好地阻止其发展。研究发现,足细胞在肾组织正常运行中发挥重要作用,足细胞损伤是导致DN产生的病理因素之一〔4〕。自噬对足细胞具有保护作用,如果自噬受到抑制,可能会引起足细胞足突、分离等损伤情况,在DN的发生发展中起到促进作用。然而机体长期处于高糖环境会抑制足细胞自噬〔5,6〕,因此想要解决DN,一方面需要降低血糖,另一方面还需要调控足细胞自噬,帮助其恢复正常自噬水平。细胞自噬受体蛋白p62是反映自噬活性的一个指标,其蛋白表达与自噬活性之间呈反比关系〔7〕。有研究发现,c-Jun氨基末端激酶(JNK)能够通过介导p62/螯合体(SQSTM)1表达,来促进细胞自噬。糖肾煎是由黄芪、太子参、茯苓、生地等采用水煮醇提的方式制成的中药提取物,临床发现糖肾煎对2型DN有一定治疗作用〔8〕,但作用机制尚未可知。本研究基于JNK-p62/SQSTM1信号通路探讨糖肾煎对2型DN大鼠足细胞的保护作用及机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 SPF级SD大鼠36只(雌雄各半),体质量约250 g,8周龄,购于三峡大学,动物生产许可证号SCXK(E)2018-0007,动物使用许可证号：SYXK(E)2018-0104。在实验过程中按照动物使用的“3R”原则给予人道主义关怀。本研究通过武汉市中医医院动物实验伦理委员会的审批(伦理批号：20211026),符合动物伦理学标准。

1.2主要试剂与仪器 链脲佐菌素(STZ,批号：20171027)购于美国Sigma公司;糖肾煎(生黄芪、太子参、山药、丹皮、茯苓、五味子、山茱萸、赤芍、地黄、三七等,批号：20170927)由武汉市中医医院药学部制备,采用“水煮醇提”法制成浸膏,临用稀释;二甲双胍购于北京市永康药业有限公司(批号：20190919,国药准字H20080072);苏木素-伊红(HE)染色液(批号：20180803)购于上海吉至生化科技有限公司(AG1120);六胺银(PASM)染色液(批号：20170916)购于上海茁彩生物科技有限公司;透射电镜(TEM)制片处理试剂盒(批号：20180926)购于上海羽哚生物科技有限公司(YDJQ3605);兔抗微管相关蛋白1A/1B-轻链(LC)3、兔抗p-JNK、兔抗JNK、兔抗p62/SQSTM1、兔抗肾病蛋白(Nephrin)、兔抗三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)及山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(批号：20160219、20180326、20181110、20170427、20190512、20171021、20180218)均购于abcam公司。三诺GA-3型血糖仪(批号：20190625)购于上海聚慕公司;迈瑞Mindray全自动生化分析仪BS-280(批号：20180327)购于南京贝登医疗股份有限公司;日本奥林巴斯OlympusBX53-P偏光显微镜(批号：20181025)购于上海辅泽商贸有限公司;蔡司高速扫描电子显微镜MultiSEM(批号：20170620)购于昆山友硕新材料有限公司;Alpha View凝胶成像仪(批号：20190311)购于苏州阿尔法生物实验器材有限公司。

1.3分组及DN模型构建 大鼠适应环境1 w后,开始进行DN模型构建。随机选取6只大鼠作为正常组,每日给予正常饲料喂养。剩余大鼠随机分为DN组、糖肾煎低、中、高剂量组(糖肾煎-L、M、H组)和二甲双胍组,每组6只,给予高脂高糖饲料喂养。各组持续喂养4 w后,除正常组外,余下各组禁食不禁水4 h,一次性腹腔注射1% STZ(35 mg/kg),72 h后,进行空腹血糖(FBG)水平检测,FBG≥16.7 mmol/L,可认为糖尿病模型构建成功〔9〕;继续饲养1 w,收集24 h尿液,检测尿蛋白含量,超过30 mg/24 h,表示DN模型成功。

1.4给药 DN模型构建完成后,各组进行药物处理。糖肾煎-L、M、H组分别灌胃糖肾煎生药5、10、20 g/(kg·d)〔10〕,正常组和DN组灌胃等量生理盐水,二甲双胍组灌胃100 mg/(kg·d)二甲双胍〔11〕。各组均每日上午灌胃1次,持续8 w。

1.5大鼠一般情况观察 药物处理结束后,观察并记录大鼠的毛发光泽度、精神状况、活动情况、饮食及排尿量等。

1.6大鼠血生化指标FBG、负荷后2 h血糖(P2 h BG)、SCr、BUN水平检测 末次给药后,禁食12 h,麻醉后,使用血糖仪检测大鼠FBG。收集腹部主动脉血液,用于检测血清中血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)水平。大鼠灌胃40%葡萄糖水2 h后麻醉,收集腹部主动脉血液用于P2 h BG检测。

1.7HE染色观察大鼠肾组织病理变化 将大鼠脱颈处死,打开腹腔取出肾脏,一部分用于观察组织病理学和超微结构,一部分-80 ℃冻存。将肾组织放入4%多聚甲醛中固定24 h后经乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡包埋后制成石蜡切片,使用HE染色,放在光学显微镜下观察肾组织病理变化。

1.8PASM染色观察大鼠肾组织病理变化 将4 μm左右肾组织石蜡切片脱蜡至水,使用高碘酸染色、乌洛托品储备液孵育染色后显微镜下观察,显色反应以肾小球毛细血管基膜呈现黑色为基准,如果着色不够,继续孵育。接着使用硫代硫酸钠进行处理,并复染伊红、脱水、封片,最后放置在光学显微镜下观察肾组织病理变化。

1.9TEM观察大鼠肾组织超微结构变化 肾组织制备成体积约1 mm3大小组织块,放置在4 ℃环境中,使用戊二醇固定2 h,锇酸固定1 h,接着制成60 nm左右薄片,经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色后,放置在TEM下观察肾组织中足细胞和基底膜的超微结构。

1.10Western印迹检测肾组织LC3、p-JNK、JNK、p62/SQSTM1、Nephrin蛋白表达 取冻存肾组织,将其在液氮中打碎研磨后进行蛋白提取和浓度测定。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白、转膜、加入0.5%脱脂奶粉封闭2 h,接着分别加入兔抗LC3、兔抗p-JNK、兔抗JNK、兔抗p62/SQSTM1、兔抗Nephrin、兔抗GAPDH(1∶1 000),4 ℃孵育过夜;之后加入山羊抗兔IgG(1∶5 000),室温下孵育1 h,通过电化学发光法进行显影,经ImageLab软件分析蛋白条带的灰度值。

1.11统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组一般情况 正常组毛发顺滑有光泽,精神状态良好,动作敏捷、饮食及排尿均正常。DN组毛发杂乱枯槁、精神萎靡,喜欢蜷缩在角落中倦怠懒动,行动迟缓,饮食量及排尿量均明显增加。糖肾煎-L、M、H组及二甲双胍组与DN组比较,大鼠精神、动作、饮食及排尿量等均有所改善,其中糖肾煎-H组及二甲双胍组改善较明显。

2.2各组血生化指标FBG、P2 h BG、SCr、BUN水平变化 DN组FBG、P2 h BG、SCr和BUN水平均明显高于正常组(P<0.05)。与DN组比较,糖肾煎-L、M、H组及二甲双胍组FBG、P2 h BG、SCr水平明显降低(P<0.05),糖肾煎-M、H组及二甲双胍组BUN水平明显降低(P<0.05),P2 h BG等水平的降低与糖肾煎剂量存在一定效应关系。与糖肾煎-H组比较,二甲双胍组上述指标差异不明显(P>0.05)。见表1。

表1 各组FBG、P2 h BG、SCr、BUN水平、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p-JNK、JNK、p62/SQSTM1、Nephrin蛋白表达变化

2.3各组肾组织中LC3、JNK、p62/SQSTM1、Nephrin蛋白表达 DN组LC3-Ⅱ、Nephrin蛋白表达、p-JNK/JNK明显低于正常组,p62/SQSTM1蛋白表达明显高于正常组(P<0.05)。与DN组比较,糖肾煎-L、M、H组及二甲双胍组LC3-Ⅱ、Nephrin蛋白表达、p-JNK/JNK明显升高,p62/SQSTM1蛋白表达明显降低(P<0.05),且糖肾煎对上述指标蛋白表达的作用效果具有剂量效应关系。与糖肾煎-H组比较,二甲双胍组LC3-Ⅱ、Nephrin、p62/SQSTM1蛋白表达及p-JNK/JNK差异不明显(P>0.05)。见表1、图1。

1～6：正常组,DN组,糖肾煎-L、M、H组,二甲双胍组图1 各组LC3-Ⅱ、p-JNK1/2、JNK1/2、p62/SQSTM1、Nephrin蛋白表达

2.4各组肾组织病理变化 HE染色：显微镜下观察可见,正常组肾小球大小正常、形状完整、结构层次清晰,毛细血管腔规则,未观察到有基质增生等情况。DN组肾小球缩小,局部有基质增生、增厚和不同程度基底膜增厚现象出现。糖肾煎-L、M、H组及二甲双胍组与DN组比较,基质增生、肾小球缩小等情况均获得一定程度改善。PASM染色：肾小球Ⅳ胶原镀银呈现出黑色。DN组与正常组比较,观察到肾小球管丛系膜明显扩张,并有基底膜增生现象。糖肾煎-L、M、H组及二甲双胍组能够不同程度减轻肾小球病理变化。见图2。

图2 各组肾组织病理(×400)

2.5各组肾组织足细胞变化 正常组毛细血管基底膜无增生等情况、形态正常,足细胞排列整齐,形态规则,足突无融合现象。DN组基底膜增厚,足细胞排列混乱,形态异常,有足突融合、线粒体减少和嵴分裂等情况,局部还有少量空泡变性等现象。糖肾煎-L、M、H组及二甲双胍组也有基底膜增生、足细胞排列相对凌乱等情况,但与DN组比较,整体不良现象均有减轻。见图3。

图3 各组足细胞结构(TEM,×20 000)

3 讨 论

据调查发现,DN已超越其他因素引起的慢性肾病,成为造成终末期肾病的首要因素〔12〕。故而寻找有效治疗DN的药物是目前急需解决的问题。FBG和P2 h BG、SCr和BUN分别是检测糖尿病和肾功能的几种重要指标〔13,14〕,当机体出现DN时,这四种指标会出现明显变化。本研究结果说明,糖肾煎能够降低DN大鼠血糖,对肾功能损伤也能发挥一定减轻作用。足细胞是肾小囊脏层上皮细胞,它与肾小球基膜、血管内皮细胞共同组成肾小球的血液过滤屏障〔15〕。本研究结果说明,糖肾煎处理对DN大鼠肾组织病理变化和足细胞损伤均具有改善效果。此外,Nephrin在维持足细胞正常形态与功能中发挥重要作用,本研究中DN组大鼠Nephrin蛋白表达明显低于正常组,与孟加宁等〔16〕研究结果一致;而不同剂量糖肾煎及二甲双胍处理的DN大鼠Nephrin蛋白表达明显高于DN组。进一步提示,糖肾煎处理对DN大鼠肾组织足细胞损伤具有保护作用。

足细胞可作为判断肾脏疾病的一种指标,它与肾小球其他细胞相比,拥有更高的基础自噬能力,从而清除有害物质,阻止自身变性和损伤〔17〕。因此,自噬对足细胞而言有着重要意义,在维持肾小球稳态中发挥关键作用。长期处于高糖环境下会抑制足细胞自噬反应,导致足细胞损伤、肾小球稳态被破坏,推动DN的发展〔18〕。因而激活自噬能够保护或改善足细胞损伤,减轻肾功能病变。LC3-Ⅱ是判断细胞自噬活性的重要指标,它的水平与自噬小体数量关系十分密切。p62也是判断细胞自噬活性的指标之一,但其表达与自噬活性呈反比〔19〕。Puissant等〔20〕研究发现,JNK和AMPK信号通路能够通过介导p62/SQSTM1表达来调控细胞自噬能力,JNK通路活化能够降低p62/SQSTM1蛋白表达,提高LC3-Ⅱ蛋白表达,从而来提高细胞自噬能力。本研究结果说明,糖肾煎能够通过提高JNK磷酸化蛋白表达,激活JNK通路,从而抑制p62/SQSTM1蛋白表达,提高LC3-Ⅱ蛋白表达,帮助足细胞维持正常自噬水平,从而改善足细胞损伤、减轻肾组织病变。