LncRNA DGUOK-AS1调控miR-204-5p对肝癌细胞MHCC97-H增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响

王磊 辛小敏 闫小燕 王秀敏

(安阳市人民医院消化内科,河南 安阳 455000)

肝癌是全球常见恶性肿瘤之一,据报道每年肝癌新增病例高达840万例〔1〕。肝内复发和转移是肝癌治疗的主要挑战,这是导致肝癌患者预后差、总体5年生存率低的主要原因〔2〕。因此,研究肝癌发生、转移的分子机制有助于开发新的肝癌治疗方法。微小RNA(miRNA)是进化保守的非编码RNA,其通过与靶mRNA互补序列结合发挥作用,参与细胞存活、细胞凋亡等广泛细胞途径〔3〕。miR-204-5p是近年发现的抑癌基因,研究指出长链非编码RNA(LncRNA)KCNQ1重叠转录物(KCNQ1OT)1通过下调miR-204-5p促进非小细胞肺癌细胞增殖和自噬、抑制细胞凋亡〔4〕。敲除Linc01234通过上调miR-204-5p诱导胃癌细胞凋亡和生长阻滞,并抑制小鼠异种移植瘤形成〔5〕。miR-204-5p低表达已被证实与肝癌转移、血管浸润和晚期分期有关〔6〕,过表达miR-204-5p对肝癌细胞存活和化疗耐药具有抑制作用〔7〕,但miR-204-5p的上游调控机制并未阐明。本研究通过生物学分析发现LncRNA脱氧鸟苷激酶反义RNA(DGUOK-AS)1与miR-204-5p存在靶向结合位点,推测DGUOK-AS1可能靶向miR-204-5p参与肝癌进展。本研究探讨干扰DGUOK-AS1对肝癌细胞MHCC97-H增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1组织来源 收集2016年3月至2018年3月间在安阳市人民医院确诊并进行手术切除的43例肝癌患者的癌组织和相应的癌旁组织(正常肝组织)。样品收集后立即保存在液氮中。所有患者术前未接受任何治疗。该研究获得医院伦理委员会批准,所有患者或其家属知情同意。

1.2细胞和试剂 肝癌细胞MHCC97-H购于中科院上海细胞库;第一链cDNA合成试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购于北京天根生化公司;DGUOK-AS1小干扰RNA(si-DGUOK-AS1)及其阴性对照(si-NC)、miR-204-5p抑制物(inhibitor)及其阴性对照(anti-miR-NC)、miR-204-5p模拟物(mimics)及其阴性对照(miR-NC)购于上海吉玛制药公司;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购于北京索莱宝公司;Transwell小室购自美国康宁公司;抗兔IgG二抗及兔抗人磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)抗体购于上海赛信通公司。

1.3实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测DGUOK-AS1和miR-204-5p表达 采用Trizol试剂从肝癌组织、癌旁组织中提取总RNA。第一链cDNA合成试剂盒进行逆转录,再用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ进行RT-qPCR分析。引物序列(5′-3′)为：DGUOK-AS1上游：TGCTCCCAGAACTCTAACCC,下游：CACCCACTCTTGAGCCACTT;GAPDH上游：CAG GAGGCATTGCTGATGAT,下游：GAAGGCTGGGGCT CATTT;miR-204-5p上游：CGAAGTTCCCTTTGTCA TCCT,下游：GTGCAGGGTCCGAGGTATTC;U6上游：GTGGACCGCACAAGCTCGCT;下游：TTGTTGAACGGCACTGTGTATAGCA;2-ΔΔCt法分析DGUOK-AS1和miR-204-5p相对表达量。

1.4细胞培养、转染和分组 MHCC97-H细胞置于含5% CO2、37 ℃湿润培养箱,用添加10%胎牛血清、1%青链霉素溶液的DMEM培养基进行培养。将对数期MHCC97-H细胞以2×105个/孔密度接种6孔板,按照Lipofectamine2000使用说明书将si-NC、si-DGUOK-AS1、si-DGUOK-AS1与anti-miR-NC、si-DGUOK-AS1与miR-204-5p inhibitor分别转染MHCC97-H细胞,收集转染48 h细胞,RT-qPCR分析转染效果,随后进行下一步实验。实验分组如下：si-NC组、si-DGUOK-AS1组、si-DGUOK-AS1+anti-miR-NC组、si-DGUOK-AS1+miR-204-5p inhibitor组。

1.5集落形成实验检测细胞克隆能力 将各组细胞按照200个/孔接种6孔板,培养箱孵育约10 d,用甲醇固定集落10 min,再用0.5%结晶紫染色20 min。显微镜下计数>50个细胞的集落数即为克隆形成数。

1.6流式细胞术分析凋亡和周期分布 周期检测：用70%乙醇固定各组细胞,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后,用500 μl的PI/核糖核酸酶(RNase)染色缓冲液中重悬1×106个细胞,室温下避光孵育15 min。流式细胞仪分析细胞周期分布。凋亡检测：收集细胞,用预冷PBS缓冲液洗涤两次。集合缓冲液调整细胞为1×106个/ml。然后分别加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和PI,流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.7Transwell实验测定细胞迁移和侵袭 取200 μl含4×104个细胞接种到涂有(侵袭)或未涂(迁移)基质胶的Transwell小室上腔中,下室加入500 μl含10%血清的培养基作为诱导因子。培养箱孵育24 h后,70%甲醇固定Transwell膜下表面细胞,0.1%结晶紫染色。显微镜下随机选取3个视野进行细胞计数,以平均值表示侵袭或迁移细胞数量。

1.8Western印迹分析Bax、Bcl-2、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达 放射免疫沉淀(RIPA)测定缓冲液裂解各组细胞,蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白样品,并转移到硝酸纤维素膜上。将膜与兔抗人Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin及GAPDH抗体4 ℃孵育过夜,再将膜与二抗室温孵育1 h。电化学发光(ECL)试剂显色后,ImageJ软件分析各条带光密度值,目的蛋白表达量以其条带和内参蛋白条带光密度值的比值表示。

1.9双荧光素酶报告基因实验 含有或未含有miR-204-5p结合位点的DGUOK-AS1野生(WT)或突变型(MUT)荧光素酶载体由上海吉玛制药公司提供。将WT-DGUOK-AS1、MUT-DGUOK-AS1分别与有miR-204-5p mimics或miR-NC共转染至MHCC97-H细胞,转染48 h后双荧光素酶报告基因检测系统测定细胞相对荧光素酶活性。

1.10统计学分析 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验。

2 结 果

2.1DGUOK-AS1和miR-204-5p在肝癌中的表达 肝癌组织中DGUOK-AS1表达量(5.15±0.33)较癌旁组织(1.00±0.15)显著升高(t=75.073,P<0.05),而miR-204-5p表达量(0.16±0.02)较癌旁组织(0.99±0.12)显著降低(t=44.739,P<0.05)。si-DGUOK-AS1组MHCC97-H细胞中DGUOK-AS1表达量较si-NC组显著降低,而miR-204-5p表达量较si-NC组显著升高(P<0.05),见表1。

表1 DGUOK-AS1和miR-204-5p表达及干扰DGUOK-AS1对MHCC97-H细胞周期和克隆形成的影响

2.2干扰DGUOK-AS1对MHCC97-H增殖的影响 si-DGUOK-AS1组MHCC97-H细胞克隆形成数、S期细胞比例较si-NC组显著减少,而G0-G1期细胞比例较si-NC组显著升高(P<0.05),见表1、图1。

图1 干扰DGUOK-AS1对MHCC97-H细胞周期、克隆形成(结晶紫染色)的影响

2.3干扰DGUOK-AS1对MHCC97-H凋亡的影响 si-DGUOK-AS1组MHCC97-H细胞凋亡率、Bax蛋白表达量较si-NC组显著升高,而Bcl-2蛋白表达量较si-NC组显著降低(P<0.05),见图2、图3、表2。

图2 干扰DGUOK-AS1对MHCC97-H凋亡的影响

表2 干扰DGUOK-AS1对MHCC97-H凋亡、迁移、侵袭及其蛋白表达的影响

2.4干扰DGUOK-AS1对MHCC97-H迁移侵袭的影响 si-DGUOK-AS1组MHCC97-H细胞迁移和侵袭细胞数、N-cadherin蛋白表达量较si-NC组显著降低,而E-cadherin蛋白表达量较si-NC组显著升高(P<0.05),见图3、表2、图4。

图4 干扰DGUOK-AS1对MHCC97-H迁移、侵袭的影响(结晶紫染色,×200)

2.5DGUOK-AS1靶向miR-204-5p 生物信息学软件预测DGUOK-AS1的靶基因发现miR-204-5p与DGUOK-AS1之间存在特异性互补序列,见图5。WT-DGUOK-AS1和miR-204-5p mimics共转染后,MHCC97-H细胞相对荧光素酶活性较WT-DGUOK-AS1和miR-NC共转染显著降低(P<0.05);而MUT-DGUOK-AS1和miR-204-5p mimics共转染后MHCC97-H细胞相对荧光素酶活性与MUT-DGUOK-AS1和miR-NC共转染无显著差异(P>0.05),见表3。

表3 双荧光素酶报告实验

2.6抑制miR-204-5p对干扰DGUOK-AS1处理的MHCC97-H迁移侵袭的影响 si-DGUOK-AS1+miR-204-5p inhibitor组MHCC97-H细胞迁移和侵袭细胞数、N-cadherin蛋白表达量较si-DGUOK-AS1+anti-miR-NC组显著升高,而E-cadherin蛋白表达量较si-DGUOK-AS1+anti-miR-NC组显著降低(P<0.05),见图6、表4。

图6 抑制miR-204-5p对干扰DGUOK-AS1处理的MHCC97-H迁移、侵袭的影响(结晶紫染色,×200)

表4 抑制miR-204-5p对干扰DGUOK-AS1处理的MHCC97-H迁移、侵袭的影响

2.7抑制miR-204-5p对干扰DGUOK-AS1处理的MHCC97-H增殖凋亡的影响 si-DGUOK-AS1+miR-204-5p inhibitor组MHCC97-H细胞克隆形成数、S期细胞比例、Bcl-2蛋白表达量较si-DGUOK-AS1+anti-miR-NC组显著升高,而G0-G1期细胞比例、凋亡率、Bax蛋白表达量较si-DGUOK-AS1+anti-miR-NC组显著降低(P<0.05),见图3、图7、表5、图8。

图7 抑制miR-204-5p对干扰DGUOK-AS1处理的MHCC97-H细胞周期和克隆形成(结晶紫染色)的影响

图8 抑制miR-204-5p对干扰DGUOK-AS1处理的MHCC97-H细胞凋亡的影响

表5 抑制miR-204-5p对干扰DGUOK-AS1处理的MHCC97-H增殖凋亡的影响

3 讨 论

研究证实,LncRNA是细胞增殖、周期分布、迁移、分化、侵袭、转移、自噬等细胞的基本调节剂,在包括肝癌在内的多种恶性肿瘤进展中发挥作用〔8,9〕。本研究结果显示,肝癌中DGUOK-AS1表达上调。功能缺失实验说明,干扰DGUOK-AS1表达对肝癌细胞具有抗增殖作用。上皮间质转化(EMT)是肿瘤转移过程中的关键步骤,上皮表型标志蛋白E-cadherin缺失、间质表型蛋白N-cadherin表达增加显著促进肿瘤细胞迁移和侵袭〔10〕。本研究结果提示,干扰DGUOK-AS1可能通过抑制EMT进而抑制肝癌细胞迁移和侵袭,干扰DGUOK-AS1通过上调Bax蛋白表达、下调Bcl-2蛋白表达显著促进MHCC97-H细胞凋亡。与本研究结论类似,文献〔11,12〕证实,DGUOK-AS1在乳腺癌、宫颈癌中表达增加,敲低DGUOK-AS1可抑制宫颈癌细胞增殖、诱导细胞凋亡。表明DGUOK-AS1在肝癌中具有致癌中作用,而干扰DGUOK-AS1表达可降低肝癌细胞的恶性生物学行为并诱导细胞凋亡。

miR-204-5p在恶性肿瘤中的抑癌作用被广泛报道。研究指出,骨肉瘤中miR-204-5p表达降低,过表达miR-204-5p导致细胞凋亡增加,迁移和侵袭能力下降〔13〕。miR-204-5p还显著抑制食管鳞癌细胞增殖、侵袭和细胞周期,诱导细胞凋亡〔14〕。LncRNA DSCAM反义RNA1(DSCAM-AS1)通过下调miR-204-5p促进乳腺癌肿瘤生长〔15〕。敲减LncRNA显著抑制胶质瘤细胞EMT进程、迁移、侵袭,其机制与上调miR-204-5p有关〔16〕。本研究证实,DGUOK-AS1与miR-204-5p的靶向关系,并揭示了DGUOK-AS1对miR-204-5p表达的负调控作用。已有文献证实,肝癌组织、细胞中miR-204-5p表达降低,且过表达miR-204-5p显著抑制肝癌细胞的增殖和克隆生成能力,而抑制miR-204-5p则增强肝癌细胞增殖和克隆生成能力〔17〕,说明靶向调控miR-204-5p可能是DGUOK-AS1在肝癌中发挥作用的途径。本研究结果提示,DGUOK-AS1靶向miR-204-5p参与肝癌进展。

综上,肝癌中DGUOK-AS1表达增加,干扰DGUOK-AS1通过靶向miR-204-5p可抑制肝癌细胞MHCC97-H增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡。DGUOK-AS1/miR-204-5p分子轴是肝癌治疗的潜在靶点。