不同剂量人生长激素对卵巢去势大鼠牙周膜干细胞成骨分化的影响

张曦萌 魏沣 韩效愈

(天津市口腔医院河西分诊部,天津 河西 300061)

绝经后女性雌激素分泌减少,此时骨质疏松发生风险明显增加,一项动物试验报道〔1〕表明,雌激素缺乏可致牙槽骨骨单位破坏,最终导致骨质疏松发生。以往临床上多以外源性给予激素为主要治疗方式,认为激素干预可明显促进骨重建,促进成骨分化,研究发现,人生长激素可促进骨组织生长〔2,3〕。虽然目前临床上已有研究认为人生长激素具有促进牙周膜干细胞成骨分化作用,但并未明确其发挥作用的具体机制〔4〕。本研究分析不同剂量人生长激素对卵巢去势大鼠牙周膜干细胞成骨分化的影响。

1 材料与方法

1.1研究动物 选取20只SPF清洁级3月龄雌性SD大鼠,体质量250～300 g,由中科检测技术服务(广州)股份有限公司提供,动物许可证号：SYXK(粤)2021-0260,22～28 ℃、相对湿度为50%～60%的清洁环境下饲养7 d,饲养过程中自由活动、进食,明暗周期为12 h。本研究经医院伦理委员会批准。主要试剂及仪器：磷酸盐缓冲液(北京伊塔生物科技有限公司);兔抗人细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2抗体〔爱必信(上海)生物科技有限公司〕;小鼠抗大鼠Runt相关转录因子(Runx)2抗体(深圳海思安生物技术有限公司)。流式细胞仪(贝克曼库尔特);倒置显微镜(赛默飞世尔科技);聚合酶链反应(PCR)仪(力康生物医疗科技控股有限公司)。

1.2卵巢去势模型构建 20只大鼠中选取10只为正常组,不做任何处理,其余10只为卵巢去势组,均腹腔注射10%水合氯醛,完整摘除双侧卵巢,建立卵巢去势模型。卵巢去势3个月后观察两组体质量、血清钙(Ca2+)、雌二醇(E2)水平、股骨骨密度(BMD),并随机选取两组中5只,做胫骨组织苏木素-伊红(HE)染色,观察胫骨组织变化。与正常组比较,卵巢去势组体质量升高,Ca2+、E2、BMD降低,胫骨组织病理改变则说明卵巢去势模型构建成功。

1.3卵巢去势大鼠牙周膜干细胞分离培养 将卵巢去势组使用戊巴比妥钠麻醉,消毒口腔,取上下颌磨牙,刮取牙周膜组织,制备组织块(大小为1 mm3),使用不含胎牛血清的α-基础伊格尔培养基(MEM)、磷酸盐缓冲液重复清洗,清洗完毕接种于T25培养瓶内,加DMEM培养基(10%胎牛血清、1%双抗),37 ℃下培养,培养液每2 d换1次,当细胞生长至80%时传代,培养至第3代。

1.4卵巢去势大鼠牙周膜干细胞鉴定 取第3代牙周膜干细胞,制备为单细胞悬液,将单细胞悬液、CD146单抗、基质细胞抗原(STRO)-1单抗加入至流式管中,混合均匀,避光环境下孵育1 h,之后洗涤细胞,加入二抗免疫球蛋白标记的异硫氰酸荧光素(Ig-FITC),避光45 min,之后使用流式细胞仪检测。

1.5卵巢去势大鼠牙周膜干细胞分组培养 将鉴定完成的牙周膜干细胞,以3×104/ml浓度的细胞接种至96孔培养板上,24 h后去除未贴壁的细胞,分为空白组、人生长激素组,空白组使用细胞液做常规细胞培养,人生长激素组分为10、50、100、150、200 μg/L 5个干预剂量亚组,分别在细胞培养液中加入10、50、100、150、200 μg/L剂量的人生长激素,培养3 d观察其变化。

1.6细胞增殖测定 采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖能力,将各组细胞以3×104/ml浓度的细胞接种至96孔培养板上,对细胞培养24、48、72 h的培养,在各个时间点加入10 μl MTT试剂,观察细胞增殖情况,增殖率=〔细胞组光密度(OD)值/参照组OD值〕×100%。

1.7成骨分化测定 对细胞做茜素红染色,观察各组细胞矿化结节形成情况,结节形成越多说明成骨分化能力越强。

1.8成骨相关基因测定 提取各组细胞RNA,对所提取RNA的纯度进行测定,当纯度为1.8～2.1内做后续指标检测,RNA反转录获得cDNA,以cDNA为模板,使用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法测定,反应体系：0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl核苷酸胶体染料,加蒸馏水至20 μl。反应条件：94 ℃预变性1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min,72 ℃延伸5 min,共进行35个循环,采用2-△△Ct方法计算出细胞中骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)表达量。引物序列：OCN上游引物：5′-CATGAGAGCCCTCACA-3′,下游：5′-AGAGC GACACCCTAGAC-3′;OPN上游引物：5′-CCAAGTAAGTCCAACGAAAG-3′,下游：5′-GGTGATGTCCTCG TCTGTA-3′;内参β-actin上游引物：5′-CTGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′,下游：5′-GAGGATC TTCATGAGGTAGTCAGT-3′。

1.9细胞碱性磷酸酶(ALP)活性检测 冲洗细胞,加500 μl曲拉通(Triton)X-100(1%)过夜,离心后留存上清液,取50 μl上清液加入至内含50 μl显色底物、50 μl检测缓冲液的石冠中,使用400～415 nm的吸光度与不同用量标准品的吸光度,测定蛋白浓度后对ALP活性进行检测。ALP活性检测试剂盒由北京索莱宝科技有限公司提供。

1.10Western印迹测定ERK1/2、Runx2信号通路蛋白表达量 提取细胞总蛋白,加入RIPA裂解液做超声裂解,在4 ℃下离心10 min(12 000 r/min)获得上清液,即为总蛋白提取物,二喹啉甲酸(BCA)测定浓度。测定蛋白提取物浓度后做蛋白变性、蛋白质分离,之后将上述产物转移至聚偏氟乙烯膜上,脱脂奶粉对其进行封闭处理,加入一抗,过夜,次日TBST洗涤,加入二抗,室温下孵育,辣根过氧化物酶(HRP)显色,获得ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2蛋白条带图,分析其表达量。

1.11统计学处理 采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1卵巢去势模型构建验证

2.1.1正常组、卵巢去势组体质量、血清Ca2+、E2、BMD对比 卵巢去势组体质量高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);卵巢去势组血清Ca2+、E2、BMD低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 正常组、卵巢去势组体质量、血清Ca2+、E2、BMD对比

2.1.2正常组、卵巢去势组胫骨组织变化 正常组骨小梁结构完整,骨基质均匀,骨皮质厚,边缘较光滑,仅有少量骨吸收陷凹。卵巢去势组骨小梁数目减少、断裂,骨基质内有较多的骨吸收陷凹,骨皮质较正常组明显变薄,边缘毛糙。见图1。

图1 两组胫骨组织(HE染色,×100)

2.2卵巢去势大鼠牙周膜干细胞培养 卵巢去势大鼠磨牙所分离的牙周膜干细胞见图2,原代细胞、第1代细胞为长梭状、点状形态,第3代细胞出现典型的长梭状、漩涡状形态。

图2 卵巢去势大鼠磨牙所分离的牙周膜干细胞(×100)

2.3卵巢去势大鼠牙周膜干细胞鉴定 CD146、STRO-1阳性表达,说明所培养的卵巢去势大鼠牙周膜干细胞为间充质来源。见图3。

图3 卵巢去势大鼠牙周膜干细胞流式细胞仪检测

2.4空白组、人生长激素组细胞增殖率对比 人生长激素组24、48、72 h细胞增殖率高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05);随着人生长激素组干预剂量增加,24、48、72 h细胞增殖率逐渐升高,呈剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 空白组、人生长激素组细胞增殖率、成骨相关基因表达量、ALP活性对比

2.5空白组、人生长激素组成骨相关基因表达量、ALP活性对比 人生长激素组OCN、OPN基因表达量、ALP活性高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05);随着人生长激素组干预剂量增加,OCN、OPN基因表达量、ALP活性逐渐升高,呈剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.6空白组、人生长激素组细胞成骨分化能力对比 空白组仅有少量矿化结节,人生长激素组矿化结节增多,且随着干预剂量增加矿化结节逐渐增多。见图4。

2.7空白组、人生长激素细胞ERK1/2-Runx2信号通路蛋白表达量对比 人生长激素组ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2蛋白表达高于空白组,差异有统计学意义(P<0.05);随着人生长激素组干预剂量增加ERK1/2、p-ERK1/2、Runx2表达量逐渐升高,呈剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、图5。

1～5：空白组、人生长激素10、50、100、150、200 μg/L组图5 各组ERK1/2-Runx2信号通路蛋白表达

表3 空白组、人生长激素组细胞ERK1/2-Runx2信号通路蛋白表达量对比

3 讨 论

绝经后妇女雌激素含量降低,骨质疏松发生率较高,骨质疏松可累及机体多个部位骨组织成骨能力,其中以牙槽骨骨量减少较为常见,在此状态下绝经后妇女罹患牙周疾病的风险明显提高。本文结果提示,卵巢去势可降低BMD,雌激素降低与牙周组织再生有关,表明高剂量的人生长激素可促进牙周膜干细胞成骨分化。

人生长激素属肽类激素,主要由垂体合成分泌,在骨组织生长中具有重要的作用,部分研究发现〔5〕,生长激素具有骨质改建的作用。目前已有报道显示,人生长激素具有促进细胞成骨分化的作用,如朱怀安等〔6〕研究发现,给予骨髓基质细胞150 μg/L的人生长激素培养,可明显促进其骨性分化。肖卓等〔7〕认为,去势大鼠接受人重组生长激素干预后可保护剩余牙槽骨并增加成骨。另外已有研究报道〔4〕,人生长激素具有促进牙周膜干细胞成骨分化的作用。上述研究成果均证实人生长激素具有促进成骨分化的作用,本文结果提示,人生长激素可促进牙周膜干细胞增殖,其中以200 μg/L浓度效果最为显著,此结果与杨俊辉等〔4〕研究结果一致。

研究认为〔8～10〕,细胞是否成骨分化可根据以下几点分析,细胞形态改变、成骨相关基因OCN、OPN表达量增加、矿化结节形成等。ALP在临床上常作为成骨标志,其活性越高说明成骨分化水平越高,多与钙化结节共同评价成骨分化能力〔11,12〕。OCN、OPN均为骨形成标志物,其中OCN经翻译生成羧化骨钙素进而参与骨骼发育,OPN与中后期成骨分化有关〔13,14〕。本研究结果提示,使用高剂量人生长激素培养的细胞成骨能力增强。细胞成骨分化过程中多信号通路活性改变,ERK属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,包括多个亚型,其中以ERK1、ERK2研究最为广泛,两者均与细胞增殖、分化能力相关,ERK1/2激活后,下游靶基因表达改变,进而诱导细胞分化、增殖〔15～17〕。随着目前临床上对ERK1/2信号通路的逐渐深入,研究发现,Runx2为此信号通路中较为重要的靶基因,Runx2是否表达与ERK1/2是否被激活相关,Runx2表达越高细胞成骨分化能力越强,两者正相关〔18〕。有报道称〔19～22〕,Runx2可与OPN、OCN等成骨相关基因特异性结合,诱导成骨分化。本文结果提示,人生长激素可能经诱导成骨基因表达、提高ALP活性发挥作用。

综上,经人生长激素培养的卵巢去势大鼠牙周膜干细胞增殖、成骨分化能力增强,高剂量最显著,其机制可能与激活ERK1/2-Runx2信号通路有关。