咪达唑仑通过调控LncRNA NR2F2-AS1对肾癌786-O细胞增殖、迁移及凋亡的影响

周宇 曹钦钰 刘蕾

(遵义市第一人民医院泌尿外科,贵州 遵义 563000)

肾癌是我国常见的一种恶性肿瘤,且呈逐年上升趋势,已严重威胁患者生命安全〔1,2〕。目前研究发现,麻醉可影响肾癌等肿瘤手术患者远期预后,患者外周血液中肿瘤细胞数量与患者生存及预后密切相关,表明静脉麻醉药对肾癌等肿瘤细胞生长及转移具有重要作用〔3〕。长链非编码(Lnc)RNA属于内源性非编码RNA分子,其富含微小(mi)RNA的结合位点,并可通过充当miRNA的竞争性内源(ce)RNA而正向调控靶基因表达从而参与肿瘤发生及发展过程〔4〕。但LncRNA是否可作为静脉麻醉药调节肾癌细胞生物学行为的潜在靶点尚未明确。咪达唑仑是常用的一种静脉麻醉药,其具有良好的镇静效果,研究表明,咪达唑仑可促进肺腺癌细胞凋亡,并可抑制肺腺癌移植瘤生长〔5〕。但咪达唑仑对肾癌细胞生物学行为的影响尚未明确。研究表明,下调LncRNA核受体亚家族2组F成员反义RNA(NR2F2-AS)1表达可抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导细胞凋亡〔6〕。但LncRNA核受体亚家族2组F成员反义RNA(NR2F2-AS)1在肾癌细胞生长及转移过程中的作用机制尚未阐明。本研究探讨咪达唑仑通过调控LncRNA NR2F2-AS1表达对肾癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 咪达唑仑(上海甄准生物科技有限公司,规格：10 mg);人肾癌细胞786-O(美国ATCC);反转录与荧光定量PCR试剂盒(北京天根生化);si-NC、si-NR2F2-AS1(广州锐博生物);pcDNA、pcDNA-si-NR2F2-AS1(上海吉满生物);CCK-8试剂、细胞凋亡检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);Transwell小室(美国Corning);兔抗人B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体(美国CST);内参GAPDH与山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)/IgG二抗(美国Santa Cruz)。

1.2实验分组 在6孔板每孔中接种对数生长期786-O细胞1×104个,加入含有不同浓度(0、20、40、60 μmol/L)咪达唑仑的DMEM培养基培养24 h〔7〕,分别记为0、20、40、60 μmol/L组。将si-NC、si-NR2F2-AS1分别转染至786-O细胞,分别记为si-NC组、si-NR2F2-AS1组。参照LipofectamineTM3000转染试剂说明书将pcDNA、pcDNA-NR2F2-AS1分别转染至786-O细胞,转染成功后加入含有浓度为60 μmol/L咪达唑仑的DMEM培养基培养24 h,分别记为咪达唑仑+pcDNA组、咪达唑仑+pcDNA-NR2F2-AS1组。

1.3CCK-8实验检测细胞增殖 将1.2中所有组别的786-O细胞1×103个接种于96孔板每孔,与10 μl CCK-8溶液反应2 h,在450 nm处,应用酶标仪测定吸光度(A)值。抑制率(%)=(1-A实验/A对照)×100%。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡率 将1.2中所有组别的786-O细胞加入胰蛋白酶消化后经3 000 r/min转速离心5 min,弃上清后用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,加入400 μl结合缓冲液悬浮细胞后分别加入5 μl膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)与5 μl碘化丙啶(PI),将上述处理后的细胞进行避光放置,放置15 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。使用Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Solarbio,北京)进行细胞凋亡测定。 首先,收集细胞并用 1×结合缓冲液洗涤2次,然后用1×结合缓冲液重悬,最终浓度为 1×106个/ml。 接下来,将 5 μl Annexin Ⅴ-FITC 和 5 μl PI溶液加入100 μl细胞悬液中,室温避光培养15 min。 最后,通过 FACScan 流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA,美国)检测样品。

1.5Transwell实验检测细胞迁移 将1.2中所有组别的786-O细胞(1×105个/孔)接种于上室,然后将600 μl培养液(含有10%胎牛血清)加入小室,48 h后将500 μl 4%多聚甲醛加入小室中固定细胞20 min,随后用1%结晶紫染色液染色10 min,最后使用显微镜观察迁移细胞数。

1.6实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测LncRNA NR2F2-AS1的表达水平 取1 ml Trizol试剂提取786-O细胞总RNA。RNA反转录合成cDNA,cDNA加入20倍焦碳酸二乙酯(DEPC)水稀释后进行RT-qPCR扩增,热循环条件：95 ℃预变性2 min,95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共循环40次。应用ABI StepOnePlus RT-qPCR仪检测LncRNA NR2F2-AS1相对表达量。

1.7Western印迹检测Bax、Bcl-2蛋白表达量 用400 μl RIPA裂解液提取1.2中所有组别的786-O细胞的总蛋白。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后蛋白样品,转膜并用5%脱脂奶粉在室温下放置2 h。分别将兔抗人Bax(1∶1 000)、兔抗人Bcl-2(1∶1 000)一抗与内参GAPDH抗体(1：3000)稀释液添加到膜中,4 ℃孵育24 h,将山羊抗兔HRP/IgG二抗稀释液(1∶5 000)加入膜中并在室温孵育1 h,成像后,ImageJ软件用于各条带灰度值测量。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、方差分析。

2 结 果

2.1咪达唑仑对肾癌786-O细胞增殖、凋亡、迁移的影响 与咪达唑仑0 μmol/L组比较,咪达唑仑20、40、60 μmol/L组细胞增殖抑制率、凋亡率和Bax蛋白水平明显升高,迁移细胞数和Bcl-2蛋白水平明显降低,且呈剂量依赖性(P<0.05),见图1、表1、图2。

表1 咪达唑仑及抑制LncRNA NR2F2-AS1对肾癌786-O细胞增殖、凋亡、迁移和对咪达唑仑处理的肾癌786-O细胞增殖、迁移的影响及细胞中LncRNA NR2F2-AS1表达

图1 各组细胞凋亡

1～8：咪达唑仑0、20、40、60 μmol/L组、si-NC组、si-NR2F2-AS1组、咪达唑仑+pcDNA组、咪达唑仑+pcDNA-NR2F2-AS1组图2 Western印迹检测各组凋亡蛋白表达

2.2咪达唑仑对肾癌786-O细胞中LncRNA NR2F2-AS1表达的影响 与咪达唑仑0 μmol/L组比较,咪达唑仑20、40、60 μmol/L组LncRNA NR2F2-AS1的表达量明显降低,且呈剂量依赖性(P<0.05),见表1。

2.3LncRNA NR2F2-AS1转染效率的检测 与si-NC组(1.00±0.00)比较,si-NR2F2-AS1组LncRNA NR2F2-AS1表达量(0.37±0.03)明显降低(t=36.373,P=0.000);与咪达唑仑+pcDNA组(1.00±0.00)比较,咪达唑仑+pcDNA-si-NR2F2-AS1组LncRNA NR2F2-AS1表达量(2.85±0.21)明显升高(t=15.259,P=0.000)。

2.4抑制LncRNA NR2F2-AS1对肾癌786-O细胞增殖、凋亡、迁移的影响 与si-NC组比较,si-NR2F2-AS1组细胞增殖抑制率、凋亡率和Bax蛋白水平明显升高,迁移细胞数和Bcl-2蛋白水平明显降低(P<0.05),见图1、表1、图2。

2.5LncRNA NR2F2-AS1对咪达唑仑处理的肾癌786-O细胞增殖、迁移、凋亡的影响 与咪达唑仑+pcDNA组比较,咪达唑仑+pcDNA-NR2F2-AS1组细胞增殖抑制率、凋亡率和Bax蛋白表达明显降低,迁移细胞数、Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05),见表1。

3 讨 论

LncRNA在肾癌组织和细胞系中表达异常,并可通过调节miRNA/mRNA表达而参与肾癌细胞生长及转移过程,还可能作为肾癌靶向治疗的潜在靶点〔8～10〕。咪达唑仑可抑制神经胶质瘤和肺癌细胞增殖〔11〕。咪达唑仑可通过促进miR-137表达而抑制胃癌细胞增殖及促进细胞凋亡〔12〕。咪达唑仑通过下调转录共激活因子p300表达而抑制人头颈部鳞癌细胞增殖〔13〕。本研究结果提示,咪达唑仑可抑制肾癌细胞增殖及迁移。Bax属于促凋亡蛋白,Bcl-2属于抗凋亡蛋白,当细胞接收凋亡信号时Bax表达上调而Bcl-2表达下调进而促进细胞凋亡〔14〕。本研究结果提示,咪达唑仑可促进肾癌细胞凋亡。LncRNA NR2F2-AS1在非小细胞肺癌细胞中高表达,其促非小细胞肺癌细胞增殖及促转移的作用机制与通过充当miR-320b的ceRNA分子而促进整合位点基因(BMI1)表达有关〔15〕。沉默LncRNA NR2F2-AS1可诱导结直肠癌细胞周期阻滞及细胞增殖〔16〕。LncRNA NR2F2-AS1可促进透明细胞肾细胞癌细胞生长〔17〕。本研究结果提示,咪达唑仑可能通过下调LncRNA NR2F2-AS1的表达而影响肾癌细胞生物学行为。同时,咪达唑仑可通过抑制LncRNA NR2F2-AS1表达而抑制肾癌细胞生长及转移,并可诱导细胞凋亡。

综上,咪达唑仑可通过抑制LncRNA NR2F2-AS1表达而抑制肾癌细胞增殖及迁移,并可促进肾癌细胞凋亡,LncRNA NR2F2-AS1可能作为咪达唑仑影响肾癌细胞生物学行为的潜在靶点。但咪达唑仑调节肾癌细胞生物学行为的具体作用机制仍需进一步探究。