光动力疗法对两种黑素瘤细胞迁移与侵袭的影响及作用机制

黎松 张敏 李蔼谕 吴亚光

[摘要]目的：初步探究光動力疗法（Photodynamic therapy，PDT）对两种黑素瘤细胞迁移、侵袭的影响及作用机制。方法：取生长至对数期黑素瘤细胞A375和B16-F10，胰酶消化离心后计数后接种至六孔板内，培养使细胞融合度达到80%～90%以上后孵育光敏剂1 mmol/L 5-氨基酮戊酸（5-ALA）2 h后使用635 nm红光照射治疗，根据照射能量的不同分为0 J（对照组）、2.4 J（PDT 2.4J组）、4.8 J（PDT 4.8 J组）。采用划痕愈合实验和Transwell侵袭实验分别检测不同水平的PDT对B16-F10及A375系两种细胞迁移和侵袭能力的影响。采用蛋白质印迹法检测迁移和侵袭相关蛋白[Ki-67、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9，MMP9）]的相对表达量。结果：细胞划痕和Transwell实验的结果显示，PDT处理24 h后，相比对照组，PDT 2.4 J组及PDT 4.8 J组在B16-F10及A375两种细胞系中，划痕愈合率及侵袭细胞数目均明显减少（P＜0.01）；相比于PDT 2.4 J组，PDT 4.8 J组的划痕愈合率及侵袭细胞数目明显减少（P＜0.01）。两PDT组在Ki-67、VEGF及MMP9三种蛋白的表达水平上均明显低于对照组（P＜0.01）；相比于PDT 2.4 J组，PDT 4.8 J组在三种蛋白的表达水平上更低（P＜0.01）。结论：光动力治疗可显著抑制黑素瘤细胞系A375和B16-F10的侵袭与迁移能力，其机制可能是光动力治疗能够抑制促肿瘤生长相关因子的释放有关。

[关键词]光动力疗法；黑素瘤细胞；迁移；侵袭

[中图分类号]R739.7    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）02-0056-04

Effect of Photodynamic Therapy on Migration and Invasion of Two Melanoma Cells and Mechanism of Action

LI Song1，ZHANG Min1，LI Aiyu2，WU Yaguang1

[1.Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital of Army Medical University（South West  Hospital），Chongqing 400038，China; 2.Department of Dermatology，People's Hospital of Shapingba District，Chongqing 400030，China]

Abstract： Objective  A preliminary investigation of the effects and mechanisms of photodynamic therapy （PDT） on the migration and invasion of two types of melanoma cells. Methods  Melanoma cells A375 and B16-F10， which grew to the log stage， were digested and centrifuged by pancreatic enzyme， counted， and inoculated into six-well plates. After culture， cell fusion reached more than 80% to 90%， the cells were incubated with photosensitizer 1 mmol/L 5-aminoketovalerate （5-ALA） for 2 h， and then treated with 635 nm red light irradiation.According to the different irradiation energy， it was divided into 0 J （control group）， 2.4J （PDT 2.4J group）， 4.8J （PDT 4.8J group）. Scratch healing test and transwell invasion test were used to detect the effects of photodynamic therapy on the migration and invasion of melanoma cell lines A375 and B16-F10. Western blotting was used to detect the relative expression of migration and invasion-related proteins [Ki-67， vascular endothelial growth factor （VEGF）， matrix metalloproteinase 9 （MMP9）]. Results  The results of cell scratches and Transwell experiments showed that after 24 hours of PDT treatment， compared with the control group， the scratch healing rate and the invasion of cells in the PDT 2.4 J group and PDT 4.8 J group were in the B16-F10 and A375 cell lines. The number was significantly reduced （P＜0.01）， compared with the PDT 2.4 J group， the scratch healing rate and the number of invaded cells in the PDT 4.8 J group were significantly reduced （P＜0.01）. Compared with the PDT 2.4 J group， the PDT 4.8 J group had the expression levels of the three proteins is lower （P＜0.01）. Conclusion  Photodynamic therapy can significantly inhibit the invasion and migration of melanoma cell lines A375 and B16-F10. The mechanism may be related to the inhibition of the expression of migration and invasion-related proteins.

Key words： photodynamic therapy; melanoma cells; migration; invasion

恶性黑素瘤约占皮肤癌的4%，发病率较低，但其具有高致死率[1]。在极早期，手术切除治疗的率可达到90%以上，然而，一旦发生远处转移，就很难有效治愈黑素瘤[2-3]。因此，常采用各种治疗策略，包括化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗以及不同类型治疗的组合来治疗晚期黑素瘤[4]。常规手术和化疗通常会引起免疫抑制作用，使癌细胞逃避免疫监视[5]。靶向疗法，免疫治疗等新兴方法极大地改变了黑素瘤的治疗方法，在生存结果方面，免疫疗法比发生肿瘤转移时的任何其他形式的治疗具有较好的疗效[6]。然而，免疫治疗领域仍然存在一些障碍，例如治疗耐药性和可负担性[7]。除了仅在少数免疫反应性黑素瘤患者中取得有限的成功外，免疫疗法可能会导致针对正常组织的严重自身免疫。PDT使用无毒光敏剂（Photosensitizer，PSs），通过吸收光而激活，成为PSs的三联体，与分子氧反应产生细胞毒性活性氧（Reactive oxygen species，ROS）来杀死癌细胞[8]。故本研究探讨光动力疗法对黑素瘤细胞迁移、侵袭的抑制作用及机制研究。

1  材料和方法

1.1 细胞和试剂：A375黑素瘤细胞系及B16-F10为本实验室长期使用及冻存的细胞株。采用此两种常用的细胞系进行相互验证。两种细胞系在Dulbecco's Modified Eagle's培养基[DMEM，Highveld Biological（Pty）Ltd.，South Africa]中培养，并添加10%（v/v）灭活的胎牛血清[Highveld Biological（Pty）Ltd.]，100 U/ml青霉素（P3032，Sigma，美国）和100 μg/ml链霉素（S-91370，Sigma，美国），并在5% CO2、95%湿度、37℃​​下孵育。Ki-67抗体，血管内皮生长因子（VEGF）抗体，基质金属蛋白酶9（MMP9）抗体均购自Abcam公司。

1.2 划痕实验：取生长至对数期黑素瘤细胞A375和B16-F10，胰酶消化离心后计数后接种至六孔板内，培养使细胞融合度达到80%～90%以上后孵育光敏剂1 mmol/L 5-氨基酮戊酸（5-ALA）2 h后使用635 nm红光照射治疗，根据照射能量的不同分为0 J（对照组）、2.4 J（PDT 2.4 J组）、4.8 J（PDT 4.8 J组），ALA-PDT分别作用0、12、24 h，拍照并采用Image J测量划痕愈合面积。

1.3 Transwell实验：取对数生长期的黑素瘤细胞A375和B16-F10，常规胰酶消化计数后用2%血清培养基把细胞以5×105/ml分别接种到包含8μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室内，根据不同分组为单独小组进行光照能量0 J、2.4 J、4.8 J的处理。下层24孔板的孔内加入含有10%胎牛血清的培养基600μl，置于细胞培养箱中培养24 h，之后取出且用PBS清洗小室3次，小室外的细胞使用4%多聚甲醛固定15 min，1%结晶紫染色15 min，拍照计数，实验重复3次。

1.4 蛋白质印迹分析：将来自A375和B16-F10的30 ug细胞提取蛋白加载到预制（10% w/v）SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳并电转移到硝酸纤维素膜上（Hybond ECL Amersham，RPN203D，GE）。然后5%脱脂牛奶封闭1 h，在4℃下一抗过夜。第2天，洗涤膜5次，每次10 min，之后加入二抗在室温下孵育1 h，然后洗膜5次，同上。使用SuperSignal West Pico化学发光ECL检测试剂（Thermo Scientific Pierce，Waltham，Massachusetts，USA）获得信号的可视化。计算Ki-67、VEGF、MMP9的表达水平。

1.5 统计学分析：采用SPSS 22.0处理分析数据，计量资料用（x¯±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析及多因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 光动力疗法对黑素瘤细胞迁移、侵袭的影响：细胞划痕和Transwell实验的结果显示，PDT处理24 h后，相比对照组，PDT 2.4 J组及PDT 4.8 J组在B16-F10及A375两种细胞系中，划痕愈合率及侵袭细胞数目均明显减少（P＜0.05）；相比于PDT 2.4 J组，PDT 4.8 J组的划痕愈合率及侵袭细胞数目明显减少（P＜0.05），表明光动力疗法抑制了黑素瘤细胞迁移和侵袭的能力。见表1、图1。

2.2 光动力疗法对黑素瘤细胞中迁移和侵袭相关蛋白表达量的影响：对照组、PDT 2.4 J组及PDT 4.8 J组在两种细胞系（B16-F10，A375）中相比较发现，PDT 2.4 J组及PDT 4.8 J组在Ki-67、VEGF及MMP9三种蛋白的表达水平上均明显低于对照组（P＜0.05）；相比于PDT 2.4 J组，PDT 4.8 J组在三种蛋白的表达水平上更低（P＜0.05）。见图2、表2。

3  讨论

皮肤癌常见类型有基底细胞癌、鳞状细胞癌和皮肤恶性黑素瘤，前两种类型是通常被称为非黑素细胞或非侵袭性皮肤癌，因为它们不起源于皮肤黑素细胞，也不会扩散到周围的健康组织[9-10]。然而，皮肤恶性黑素瘤往往会扩散到周围组织，因此被认为是具有转移性、侵袭性的[11]。黑素瘤起源于表皮的最深区域和真皮的起始区域，那里是产生黑色素的黑素细胞所在的区域。因此，它是从单个黑素细胞发展而来的，该细胞要么恶性转化，要么由于发育不良痣的功能障碍[12-13]。转移性黑素瘤被认为是皮肤癌Ⅳ期的晚期形式，当表皮中的癌细胞转移并进展到远离原发部位的身體其他器官时就会发生[14]。黑素瘤的早期诊断是至关重要的，转移前的早期阶段，因为一旦扩散，很难定位其起源，因此往往会阻碍治疗和患者的生存率[15]。黑素瘤的最常见原因归因于紫外线辐射（Ultraviolet，UV）暴露、家族史和黑素瘤个人史[16]。其具有较高的多药耐药性、极低的患者存活率和容易复发的倾向。皮肤恶性黑素瘤是最致命的皮肤癌，占皮肤癌相关死亡的75%以上[17]。尽管目前有多种疗法，包括化学疗法、免疫疗法、放射疗法和生物化学疗法，但晚期转移性黑素瘤往往对化学疗法难以治愈，5年生存率仅为15%[18-19]。

過去30年来，PDT作为一种非常规的癌症治疗方法得到了广泛研究。涉及将光敏药物施用于靶向癌细胞，并将激光定位在适当的波长上用于激发PS[20]。PS的激发导致细胞毒性ROS的产生，例如单线态分子氧、羟基自由基和/或超氧阴离子，通过氧化应激癌细胞实现光细胞毒性，从而诱导对其细胞生物分子（即脂质、蛋白质和核酸）造成损害，使其失去活性[21]。这种非常规的治疗方式比传统的癌症治疗方式侵入性更小，其专门针对癌性肿瘤区域，因此产生局部破坏且副作用有限。PDT的两种作用机制都发生在依赖氧气的环境中，两种类型都产生氧气[22]。然而，1型反应产生超氧阴离子自由基，而2型反应产生单线态氧。决定这种作用方式的因素包括：PS浓度、PS定位、细胞内三磷酸腺苷的量、细胞的基因组成以及作为激光照射的通量和波长。然而，PDT诱导的免疫刺激作用也与肿瘤损伤相关的急性炎症密切相关[23]。尽管在非黑素瘤皮肤癌治疗方面取得了进展，但PDT治疗黑素瘤的应用还没有得到实质性的推进，主要是由于其有效性受到光线穿透深度差和缺乏理想PS的限制[24]。

在本研究中采用了两种黑素瘤细胞系，通过细胞划痕和Transwell实验的结果显示，在经过PDT处理24 h后，相比对照组，PDT 2.4 J组及PDT 4.8 J组在B16-F10及A375两种细胞系中，划痕愈合率及侵袭细胞数目均明显减少；相比于PDT 2.4 J组，PDT 4.8 J组的划痕愈合率及侵袭细胞数目明显减少。这表明随着剂量以及时间的增加，黑素瘤细胞受抑制程度也随之增加。张召力等人在B16-F10细胞系中也发现高剂量组抑制迁移和侵袭的能力更强[25]。为了进一步探究相关机理，笔者对相关蛋白进行检测，发现ALA-PDT组在Ki-67、VEGF及MMP9三种蛋白的表达水平上均明显低于对照组；相比于PDT 2.4 J组，PDT 4.8 J组在三种蛋白的表达水平上更低。肿瘤血管生成是肿瘤细胞转移生殖的重要因素，VEGF是促生长因子，能够加速血管腔的形成[26]。Ki-67与细胞增殖密切相关，其表达水平可反应细胞的增殖活性。MMP9能够降解细胞外基质，在肿瘤的迁移和侵袭中发挥关键作用。在本研究中，PDT处理后，VEGF、Ki-67及MMP9的水平均下降，表明PDT处理能够抑制促肿瘤生长相关因子的释放，从而抑制肿瘤细胞的迁移侵袭。

PDT具有成为转移性黑素瘤理想肿瘤干预的巨大潜力，能够选择性地破坏原发肿瘤及其微环境，同时激发免疫系统攻击任何剩余或复发的黑素瘤细胞。然而，PDT尚未被接受为癌症患者的一线临床选择这一事实主要是因为其效率低下。例如，局部应用5-ALA受到皮肤渗透性差和生物利用度低的限制，仅适用于一些非恶性皮肤癌。未来可能需要将PDT与其他治疗策略相结合才能实现癌症的完全缓解和治愈。

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[收稿日期]2023-05-11

本文引用格式：黎松，张敏，李蔼谕，等.光动力疗法对两种黑素瘤细胞迁移与侵袭的影响及作用机制[J].中国美容医学，2024，33（2）：56-59.