6 种非标农药的改进QuEChERS结合GC-MS/MS技术检测方法的建立与应用

苏雅航，车颖欣，李永丽，刘俊，唐诗，李海涛，唐俊妮*

（1.西南民族大学食品科学与技术学院，四川成都 610041）（2.成都海关技术中心，四川成都 610041）（3.食品安全检测四川省食品安全重点实验室，四川成都 610041）（4.天津市理化分析中心有限公司，天津 300051）

农药是指在农业生产活动中能够保证农业产量，通过化学合成或来源于生物、天然物质的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂[1]，主要用于预防、控制危害农业、林业的病、虫、草、鼠和其他有害生物以及有目的地调节植物、昆虫生长[1,2]。在我国，平均每年需使用约180 万t 农药，约5%的农作物存在农残超标问题，主要集中在水果和蔬菜中，农残比例远远高于其他发达国家[3]。农药的大量使用不但造成了严重生态污染，对人类健康产生影响。同时我国作为农业大国，由于部分出口果蔬存在农残超标，屡遭国外拒收、扣留、退货、索赔、撤消合同甚至销毁，造成了严重的经济损失[4]。因此，简便、高效、灵敏度高的农残检测方法的建立具有重要意义。

在农残检测中，常见的提取净化方法有：索氏萃取、加速溶剂萃取、分散液液微萃取、固相微萃取、基质固相分散及QuEChERS 等，其中QuEChERS方法因其快速、简单、廉价、有效、可靠、安全、的特点已成为最常用的提取净化方法之一[5,6]。传统的QuEChERS 方法是用乙腈（不含水分的样品需加入一定量的水）进行萃取，加入NaCl、MgSO4等盐类通过盐析作用辅助相分配，后加入吸附剂净化，该方法可用于分析高极性、高酸性等多种化合物，适用于脂肪含量低、含水量高的样品的检测，目前已广泛应用于蔬菜、水果和茶叶等不同基质中的农药检测[7]。然而，QuEChERS 净化某些基质存在局限性，如检测高色素样品时，呈高基质效应、低灵敏度[8]。因此，在实际样品检测中，可根据样品性质对QuEChERS 方法进行改良。

已有国内外学者采用QuEChERS 方法结合GC-MS/MS 进行农残检测研究，如Lee 等[9]采用改良QuEChERS 方法结合GC-MS/MS 技术建立一种19 种基质（糙米、橙子、菠菜、马铃薯）中360 种农药检测方法，样品回收率在70%～120%之间，相对标准偏差RSD ≤20%；Xie 等[10]采用改良QuEChERS 方法结合GC-MS/MS 技术检测青贮饲料中258 种农药残留，农残化合物检出限在0.5～50 µg/kg 之间，样品回收率为66.5%～119.8%，RSD＜20%。

本实验选取的6 种农药物质在我国食品安全国家标准中暂无检测标准，该6 种农药物质却为欧盟及日本进出口果蔬中农残重点检测对象，且在国内外有关于农残测定的研究中，鲜有采用改良QuEChERS 方法结合GC-MS/MS 技术对此6 种农药物质在蔬菜基质中建立检测方法的报道。因此，本实验在研究过程中，通过对QuEChERS 法的提取溶剂、提取剂用量、NaCl、MgSO4、PSA、GCB 用量等方面进行优化，对蔬菜基质效应（Matrix Effect，ME）进行探究，并对建立的方法进行延伸应用探究。旨在建立一种高效、灵敏度高、成本低廉的农残检测方法，为国内食品安全检测中此类农药的残留以及我国本土企业出口蔬菜时对此类农残的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料、试剂

GCMS-TQ8040 气相色谱-三重四级杆质谱联用仪，日本岛津公司；3H20RI 离心机，中国赫西公司；AE240 电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；XW-80A 旋涡混合器，中国HUXI 公司；Mili-Q Integral 3 超纯水仪，美国Millipore 公司。

标准品：二甲基敌草索、唑嘧菌胺、解毒喹，标准品质量浓度均为1 000 µg/mL，上海安谱实验科技有限公司；草乃敌、唑蚜威，标准品质量浓度均为100 µg/mL，北京振翔科技有限公司；邻苯基苯酚钠，标准品质量浓度为100 µg/mL，成都朗科道科技有限公司。

乙腈、丙酮、甲醇、正己烷（色谱级），Fisher公司；N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳黑（GCB），上海安谱实验科技有限公司。

样品：本实验用叶菜类样品均来自成都海关技术中心送检样品（如小白菜、生菜、卷心菜等）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

标准储备液：准确移取各目标化合物标准品1 mL，根据目标化合物性质不同分别采用甲醇、乙腈、丙酮或正己烷溶解，定容至10 mL，配制成质量浓度为100 µg/mL 或10 µg/mL 的标准储备液，4 ℃下冷藏避光保存。

混合标准工作液：准确移取一定量各目标化合物标准储备液氮吹至近干，用丙酮复溶，配制成质量浓度为10 µg/mL 的混合标准工作液。

标准储备液：准确移取各目标化合物标准品1 mL，根据目标化合物性质不同分别采用甲醇、乙腈、丙酮或正己烷溶解，定容至10 mL，配制成质量浓度为100 µg/mL 或10 µg/mL 的标准储备液，4 ℃下冷藏避光保存。

混合标准工作液：准确移取一定量各目标化合物标准储备液氮吹至近干，用丙酮复溶，配制成质量浓度为10 µg/mL 的混合标准工作液。

1.2.2 前处理方法

称取10 g 样品（精确至0.01 g）于50 mL 塑料离心管中，加入15 mL 乙腈、4 g 硫酸镁、1.5 g氯化钠及1 g 陶瓷均质子，剧烈震荡1 min 后于8 000 r/min 离心5 min。吸取6 mL 上清液加到内含900 mg 硫酸镁、125 mg PSA 的塑料离心管中，涡旋混匀1 min 后于8 000 r/min 离心5 min，准确吸取1 mL 于试管中氮吹至近干，加入1 mL 丙酮复溶，过微孔滤膜用于测定。

1.2.3 空白基质溶液的配制

称取10 g 空白样品（已检测不含目标化合物），按照1.2.2 提取净化方法处理，取5 mL 净化液于试管中氮吹至近干，加入5 mL 丙酮复溶备用。

1.2.4 仪器条件

色谱条件：色谱柱：Rtx-5MS 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；升温程序：初始温度为50 ℃保持1 min，以25 ℃/min 的速率升至125 ℃，再以10 ℃/min 的速率升至300 ℃，保持5 min；进样口温度：250 ℃，进样量：1 µL，不分流进样，载气：氦气。

质谱条件：电子电离源，电子能量为70 eV，离子源温度：230 ℃，接口温度250 ℃，溶剂延迟时间：6.5 min；采用MRM 模式。

1.2.5 数据处理

实验数据采用Excel 进行记录，通过岛津Labsolutions 4.30 软件进行分析，采用Origin 2018软件画图。

2 结果与分析

2.1 质谱检测条件的优化

取6 种目标化合物混合标准工作液稀释至质量浓度为5 µg/mL 用于检测，在1.2.4 中色谱条件下，采用（scan）全扫描模式自动进样进行分析，确定各目标化合物保留时间、前体离子，后对前体离子加以3～60 eV 的碰撞能量自动优化碰撞电压，即得到各前体离子产生的子离子以及最优碰撞电压，从中选取响应强度高、质荷比大、特异性强的离子对作为定量离子对与定性离子对。各目标化合物保留时间、定量离子对、定性离子对、碰撞能量见表1，6 种农药物质总离子流图见图1。结果表明此6 种农药物质在20 min 内能够得到良好的分离与检测，经优化得出各物质的定量（性）离子对相对应的最优碰撞能量为12～42 eV，在最优碰撞能量下其对应的离子对能够达到响应强度最高。

表1 6 种农药保留时间、CAS号、分子式、定量离子对、定性离子对、碰撞电压Table 1 Retention time,CAS number,molecular formula,quantitative ion pair,qualitative ion pair and collision voltage of 6 pesticides

图1 6 种农药物质总离子流图Fig.1 Total ion current diagram of 6 pesticide substances

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取剂的选择

QuEChERS 法中常用的提取溶剂有乙腈、丙酮、体积分数1%醋酸乙腈、乙酸乙酯、甲醇等[11,12]。根据目标化合物的理化性质，本实验选取乙腈、丙酮、1%醋酸乙腈作为提取溶剂，其他前处理步骤同1.2.2 中处理（小白菜、卷心菜、生菜等蔬菜基质较为干净，处理方法相同），以比较三种提取溶剂的提取分离效果，结果见表2。

表2 采用不同提取剂的农药回收率Table 2 Recovery rate of pesticides with different extractants

乙腈能够与大多数化合物互溶，与其他溶剂相比更容易通过盐析作用将目标化合物从水相中分离出来，且通用性强，能够极大地避免样品中油脂的流入[13,14]，实验结果也表明乙腈提取效果最优，6种目标化合物回收率均在80%～120%，符合欧盟农药残留分析质量控制程序：农药平均回收率在70%～120%之间[15]的要求。而选取丙酮有3 种化合物回收率不符合要求，与乙腈相比，丙酮极性较强、易挥发，作为进样溶剂直接萃取可以简化氮吹浓缩、复溶环节，但丙酮毒性较强，容易溶解样品中的色素及油脂[16]，易与水互溶，增加净化难度甚至损伤仪器[12,14,17]；1%醋酸乙腈溶液建立缓冲体系，可以避免目标化合物分解，保护碱敏感性农药[14]，但在本实验中有3 种农药物质提取效果不理想，因此选用乙腈作为提取剂。

2.2.2 提取剂用量

提取剂的用量对农药化合物的提取效果也起着关键作用，提取剂用量过少导致提取不充分、提取效率低；提取剂用量过大则可能干扰检测结果，造成环境污染、试剂浪费[18]。因此，本实验设置4 个提取剂水平：5、10、15、20 mL，每个水平做三个平行，其他前处理步骤同1.2.2 中处理，结果见图2。结果表明，随着提取剂用量的增大，各农药物质回收率呈上升趋势，在提取剂用量为15～20 mL 时各样品回收率能够达到最优，提取剂用量为20 mL 时较比15 mL 无明显增长，因此为避免浪费，选取提取剂用量为15 mL。

图2 不同提取剂体积下农药回收率Fig.2 Pesticide recovery rate under different extractant volumes

2.2.3 MgSO4与NaCl用量

果蔬样品中含水量较高，接近75%[19]，因此在前处理环节需选择合适的除水剂，且对农药化合物本身无影响。MgSO4可与样品中水分结合生成MgSO4.7H2O 起到除水作用，QuEChERS 法中即采用MgSO4除水，但MgSO4在水合过程中会剧烈放热，适当地温升可能促进农药化合物的萃取，也可能会引起农药化合物的热分解[12,19,20]，过量的MgSO4还会导致吸水结块[21]。因此，本实验中MgSO4用量参照GB 23200.113-2018[22]，在提取阶段加入4 g MgSO4、净化阶段加入900 mg MgSO4，以避免净化液中含有水分对仪器造成损伤。

样品通过液液分层使得目标化合物溶解于有机相层被提取出来，而乙腈微溶于水，会导致有机相层残留水分损伤仪器，NaCl 的加入能够增强离子强度，通过盐析作用降低目标化合物在水中的溶解度，提高极性化合物的回收率，但过量的NaCl 反而使样品回收率降低[12,19-21]。本实验设置4 个NaCl 添加水平：0.5、1、1.5、2 g，每个水平做三个平行，其他前处理步骤同1.2.2中处理，结果见图3。结果表明，当NaCl 添加水平在1～2 g 时，各目标化合物回收率均在80%～110%之间，变化不明显，当NaCl 添加水平在1.5 g 时，大部分目标化合物回收率达到最高，而NaCl 用量达到2 g 时，5 种农药物质回收率呈下降趋势。因此本实验NaCl 添加量确定为1.5 g。

图3 不同NaCl 用量下农药回收率Fig.3 Pesticide recovery rate under different NaCl dosage

2.2.4 PSA用量

PSA 是在高纯硅胶基质上键合N-丙基乙二胺[16]，能够吸附样品中的有机酸、极性色素、糖类、碳水化合物、脂肪酸等极性杂质[16,23-25]，适量的PSA 添加能够对样品提取液起到净化作用，提高样品回收率，但由于PSA 含有两个氨基，能够使净化液呈碱性[26]，同时PSA 还会使含羟基、氨基、巯基等官能团的农药化合物形成氢键作用，过量添加会使某些农药化合物回收率偏低[26]。因此，本实验设置5 个PSA 添加水平：100、125、150、175、200 mg，优化PSA 用量，其他前处理步骤同1.2.2 中处理，结果见图4。结果表明，PSA 在100～200 mg 添加范围内，各目标化合物回收率均在70%～120%范围内，随着PSA 用量的增加，回收率呈上升趋势，当PSA用量达到125 mg 大部分的农药物质回收率出现下降现象，因此为保证大多数农药物质回收率达到最高，选取PSA 用量为125 mg。

图4 不同PSA 用量下农药回收率Fig.4 Pesticide recovery rate under different PSA dosage

2.2.5 GCB用量

GCB 能够除去样品中色素、维生素、甾醇等物质[12]，由于其表面存在六元环结构，所以对对称及平面结构分子吸附性较强[27]，例如含有芳香环、结构具有一定对称性的农药化合物[12]。因此，GCB 用量过多会导致部分化合物回收率偏低，需对GCB用量进行优化。本实验设置5 个GCB 添加水平：0、5、10、15、20 mg，来探究GCB 的最佳添加量，其他前处理步骤同1.2.2 中处理，结果如图5。结果表明，目标化合物中只有草乃敌、唑蚜威、唑酮草酯三种农药化合物在GCB 添加量为5 mg 时，回收率达到最大，其他6 种目标化合物的回收率均随着GCB 用量的增加而降低，在68.5%～111%范围内变化，当净化环节不添加GCB 时，各目标化合物回收率为84%～104.5%，均符合农残检测要求。因此，本实验在净化环节选择仅添加PSA 作为净化剂，而不使用GCB 净化样品提取液。

图5 不同GCB 用量农药回收率Fig.5 Pesticide recovery rate of different GCB dosage

2.3 基质效应

基质效应（Matrix Effect，ME）是指在样品中存在除目标化合物以外的其他基质成分对目标化合物的测定产生的影响[28,29]，能够反映样品的净化效果[30]。目前，有以下几种方式减小基质效应：（1）净化条件的优化；（2）色谱条件的优化；（3）质谱条件的优化；（4）内标物的选择等[31]，最常用的方法是配制空白基质匹配标准溶液进行校正，抵消基质效应[30]，本文按照1.2.3 方法配制空白基质匹配标准溶液进行探究，按以下公式对基质效应进行评估：

式中：

A——基质标准曲线斜率；

B——纯溶剂标准曲线斜率。

|ME|＜20%为弱基质效应，可无需采取措施；20%≤|ME|≤50%为中等基质效应，|ME|＞50%为强基质效应，须采取措施抵消基质效应[32]，结果见表3。结果表明，6 种物质的基质效应在-8.39%～-1.68%之间，表现为弱基质效应，因此可不采用空白基质匹配标准溶液进行校正。

表3 6 种农药检出限、基质效应、平均回收率、精密度Table 3 Detection limit,matrix effect,average recovery and precision of 6 pesticides

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系与检出限

本实验采用空白基质将混合标准工作液稀释成0.002～0.5 µg/mL 共8 个浓度梯度，按1.2.4 仪器条件进行检测，以质量浓度为横坐标（x）、质谱峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线。采用逐级稀释法，以3 倍信噪比（S/N=3）为方法检出限（LOD）[33]，结果见表4。结果表明，各目标化合物在相应浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.998，6 种目标化合物检出限为0.15～2.32 µg/kg，符合日本和欧盟对农残“一律标准”中农药限量低于0.01 mg/kg 的要求[20]。

表4 6 种农药线性范围、线性方程、相关系数、检出限Table 4 Linear range,linear equation,correlation coefficient and detection limit of 6 pesticides

2.4.2 回收率和精密度

取空白样品按0.01、0.02、0.05 mg/kg 三个添加水平加入混合标准工作液，按1.2.2 方法进行提取净化，每个添加水平重复6 次，结果见表5。由表5 可知，6 种目标化合物平均回收率在84.50%～106.23%之间，精密度RSD 为0.96%～8.35%，实验结果均符合欧盟农药残留分析质量控制程序要求：农药平均回收率在70%～120%之间，重复性低于20%[15]。

表5 6 种农药混合标准品添加量、平均回收率、精密度Table 5 Addition amount,average recovery rate and precision of 6 pesticide mixed standards

2.5 检测方法的延伸应用

选取增效胺、唑酮草酯、肟醚菌胺3 种在我国食品安全国家标准：如GB 23200.113[22]等植动物源性食品中农药及其代谢物残留量的测定标准中均暂无采用GC-MS/MS 技术测定的农药物质进行方法的延伸应用探究，采用本实验已建立的方法对此3 种农药物质进行实际样品检测，并得出其保留时间、定量（性）离子对、碰撞电压、线性关系、检出限、基质效应、平均回收率及精密度等信息，如表6 和表7 所示；以响应强度为纵轴，保留时间为横轴作图，3 种农药物质色谱图见图6～8。结果表明，使用建立的方法检测此3 种农药物质效果良好，得到的检出限、回收率、精密度均符合上文提到的欧盟农药残留分析质量控制程序要求[15]，与日本和欧盟对农残“一律标准”中农药限量要求[20]；说明本实验建立的检测方法具有通用性，其应用性良好。

表6 3 种农药的保留时间、定量离子对、定性离子对、碰撞电压Table 6 Retention time,quantitative ion pair,qualitative ion pair and collision voltage of 3 pesticides

表7 3 种农药线性范围、线性方程、相关系数、检出限、基质效应、平均回收率、精密度Table 7 Linear range,linear equation,correlation coefficient,detection limit,matrix effect,average recoveryand precision of three pesticides

图6 增效胺色谱图Fig.6 Chromatogram of synergetic amine

图7 唑酮草酯色谱图Fig.7 Chromatogram of carfentrazone-ethyl

图8 肟醚菌胺色谱图Fig.8 Chromatogram of orysastrobin

3 结论

本实验通过质谱检测条件优化建立6种非标农药物质的GC-MS/MS 仪器检测方法。根据QuEChERS提取净化方法对提取剂、提取剂用量、NaCl 用量、PSA、GCB 用量等影响因素进行优化，确定前处理方法，得出样品平均回收率为80.43%～101.53%、相对标准偏差为2.17%～9.86%，检出限（LOD）为0.15～2.32 µg/kg。以上结果均能够符合欧盟农药残留分析质量控制程序要求，即农残回收率需在70%～120%之间，相对标准偏差低于20%；农残检出限结果能够满足日本和欧盟对农残“一律标准”中农药限量中农残标准低于0.01 mg/kg 的要求。近年来，对于此6 种农药物质在蔬菜基质残留的GC-MS/MS 技术检测鲜有报道，仅有少数文章对农药唑嘧菌胺进行气相色谱-质谱联用技术检测的研究，其得到的结果检出限为0.02 mg/kg，而本实验得出检出限为0.002 32 mg/kg，对比可知，本实验检测方法更加灵敏高效。

该方法操作简便、重复性好、提取效率高、基质效应弱、灵敏度高，能够满足国家标准与日本和欧盟对农残检测的要求。进一步将本实验建立的方法应用于其他3 种蔬菜基质高发农药物质的检测，其检测效果良好，同样符合上述标准。本实验研究为邻苯基苯酚钠等农药残留的检测提供了新的理论依据，为我国本土企业出口蔬菜时对此类农残的检测提供参考，减少企业经济损失。