云南野生余甘子鞣花酸和漆黄素的减肥降脂作用

林倩如，胡海娥，李学莉，马瑞婷，徐璐，刘果，邓晰文，侯韬，阚启鑫，陈宇立，曹庸*

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（2.东鹏饮料基团股份有限公司，广东深圳 518055）

随着生活水平提高和饮食习惯改变，全球肥胖人数逐年增多。据世界卫生组织统计，2016 年，18岁及以上的成年人中逾19 亿人超重，超过6.5 亿人肥胖。肥胖是会损害机体健康的过量脂肪累积情况，是引发非酒精性肝损伤（NonAlcoholic Liver Injury，NAFLD）、心血管疾病（Cardiovascular Disease，CVD）、2型糖尿病（Type 2 Diabetes，T2DM）等疾病的危险因素[1,2]，已经是不容忽视的慢性疾病。科学预防和及时治疗是有效解决肥胖的措施，而利用具有减肥降脂的天然产物是近年来被广泛关注的重要手段之一。

研究发现，含有余甘子（Phyllanthus emblica，PE）的“四味余甘子方”能够改善高脂血症大鼠的血脂水平[3]，PE 的水提物可以通过保护肠道微生物群改善NAFLD[4]。PE 具有减肥降脂作用，但关于其具体作用成分鲜有报道。本团队在前期研究中发现，云南野生PE 富含黄酮多酚物质，尤其是鞣花酸，而黄酮多酚物质被证实可以通过调节机体的肠道菌群、抗炎达到减肥降脂的效果[5,6]。同时，本团队发现余甘子中的黄酮物质——漆黄素，具有抗炎活性，能够显著抑制巨噬细胞产生一氧化氮（Nitric Oxide，NO）等炎症因子（P＜0.05）[7]。基于该背景，提取云南野生PE 的黄酮多酚物质（Phyllanthus emblicaExtract，PEE），研究其对3T3-L1 细胞分化和成脂作用的影响，并利用HFD 小鼠模型，研究鞣花酸和漆黄素（Ellagic Acid and Fisetin，EF）的减肥降脂作用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

云南野生余甘子，采摘于云南滇西干热河谷区域（101°E，25°N），由东鹏饮料（集团）股份有限公司提供；3T3-L1 细胞，由中国科学院干细胞库提供；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS，10270106）、新生牛血清（New-born Calf Serum，NCS，26010074）、DMEM 培养基（11965092）、抗生素（10 000 U/mL，15140163）、胰酶（25200056），购自Invitrogen Gibco；无水乙醇（AR）、异丙醇（AR），购自上海泰坦科技股份有限公司；鞣花酸（HPLC≥98%）、漆黄素（HPLC ≥98%）、羧甲基纤维素钠（Carboxymethylcellulose Sodium，CMC，CP，黏度300～800）、胰岛素（Insulin，RI，猪胰腺，≥27 USP units/mg）、地塞米松（Dexamethasone，DEX，BR，99%）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-Isobutyl-1-Methylxanthine，IBMX，≥99%），购自上海源叶生物科技有限公司；总甘油三酯（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Total Cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（Low Density Lipoprotein Cholesterin，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（High Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）、谷丙转氨酶（Alanine Transaminase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所有限公司；改良油红O 染液，购自上海碧云天生物技术有限公司。

超声机（JM-38D-80），洁盟；冻干机：（LL3000），Thermo；超净工作台（LVG-4AG-S8）、二氧化碳培养箱（CCL-170-B-8），ESCO ；EnSpire 多功能酶标仪，PerkinElmer；倒置生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限责任公司；分析性高效液相（LC-10ATvp plus），日本岛津；反向C18 色谱柱（250 nm×4.6 mm×5 μm），DiKMA。

1.2 方法

1.2.1 云南野生PE鞣花酸、漆黄素定量分析

参考前期研究[7-9]，称取1 g云南野生PE，切碎后冻干处理，加入70%（V/V）乙醇，物料比为1:7（m/V），50 ℃，80 kHz 超声浸提1 h 后过滤，重复2 次，合并滤液，定容至100 mL。参考文献[10,11]，利用高效液相色谱进行分析。色谱柱：DiKMA 反向C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；检测波长：273 nm；进样体积：20 μL；流动相：一级水（A，0.1%甲酸）、甲醇（B）；洗脱程序：0～6 min，5%～7% B；6～16 min，7%～30% B；16～31 min，30%～80% B；31～40 min，80%～90% B。根据鞣花酸和漆黄素的标准曲线算出两者在PE 中的含量。

1.2.2 PEE提取

重复1.2.1 步骤，提取1 kg 云南野生PE，滤液50 ℃减压浓缩，回收乙醇，剩余浓缩物冻干处理得到PEE，得率为5.79%，用于后续实验。

1.2.3 PEE对3T3-L1细胞降脂的影响

1.2.3.1 试剂配置

完全培养基1：DMEM，10% NCS（V/V），1%抗生素（V/V）；

完全培养基2：DMEM，10% FBS（V/V），1%抗生素（V/V）；

诱导分化培养基1：DMEM，10% NCS（V/V），1% 抗生素（V/V），0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/mL DEX，10 μg/mL IR；

诱导分化培养基2：DMEM，10% FBS，1%抗生素，10 μg/mL IR。

1.2.3.2 细胞培养

3T3-L1 细胞在完全培养基1 中培养，放入37 ℃、5% CO2（V/V）的培养箱中静置培养。当细胞长至对数期时进行传代。

1.2.3.3 细胞毒性

将细胞培养至对数期，以每毫升1×105个细胞的密度接种至96 孔板，每孔加入100 µL 细胞悬液，放入培养箱中培养过夜。弃去96 孔板中培养基，样品组加入100 μL 质量浓度为50～1 000 μg/L的PEE 溶液，PEE 使用完全培养基1 溶解稀释，同时设置不添加样品的空白组，不添加样品和细胞的调零组，每组设置6 个复孔。培养24 h 后，弃去培养基，每孔加入100 μL 完全培养基1 和10 µL 的CCK-8 染色液，培养箱中孵育2 h。于450 nm 处测定各孔光密度（OD）值，并按式（1）计算样品干预后细胞的存活率。

式中：

F——细胞存活率，%；

OD1——样品组的OD值；

OD2——调零组的OD值；

OD3——空白组的OD值。

1.2.3.4 PEE对3T3-L1细胞分化的影响

先使用完全培养基2 将3T3-Ll 细胞以每毫升1×105个细胞的密度接种于12 孔板，每孔1 mL。细胞融合48 h 后，更换含有样品的诱导分化培养基1 刺激分化48 h。然后更换含有PEE 的诱导分化培养基2，继续诱导分化48 h。之后更换含有样品的完全培养基2 继续培养48 h。对细胞进行油红O 染色，并在显微镜下观察和拍照。拍照完毕后，每孔加入1 mL 异丙醇溶解出染色的油红O 染剂，酶标仪检测570 nm 处的吸光度值，分析细胞的相对脂滴含量。

1.2.3.5 TG、TC含量测定

3T3-L1 细胞同1.2.2.3 步骤分化后，收集细胞，超声破碎，检测其TG、TC 含量。

1.2.4 EF对HFD小鼠的影响

1.2.4.1 动物实验分组

健康雄性C56BL/6J 小鼠（20±2）g，40 只，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司（SCXK（浙）2019-0001），合格证编号为20220228Abzz0619000297，饲养于华南农业大学实验动物中心SPF 级动物实验室（SYXK 2014-0136）。适应性喂养1 周后，随机分为5 组（n=8），具体分组及处理见表1。饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司，正常饮食饲料为标准饲料（TP23302），高脂饮食饲料脂肪供能比为60%（TP23300）。小鼠每笼4 只，群养，饲养温度23～26 ℃，相对湿度：40%～70%，采用10 h:14 h 昼夜间断照明。试验期间，每天对试验动物灌胃一次，各组动物自由饮水，8 周后，对小鼠禁食12 h（不禁水）麻醉解剖。

表1 小鼠分组及饲养方式Table 1 Groups and feeding methods of mice

1.2.4.2 生化指标测定

（1）小鼠摄食量、体质量

灌胃开始后，每天固定时间记录小鼠摄食量，每周同一时间称量小鼠体质量。

（2）血清指标

小鼠麻醉后，心脏取血，静置4 h 后，常温离心8 min，转速为5 000 r/min，血清转移至洁净的离心管中，放置于-80 ℃中冻存待测。利用试剂盒对小鼠血清生化指标含量进行测定。

（3）肝脏指数

小鼠取血后，断颈处死，解剖摘取肝脏，棉球去除多余血液后称质量记录，按公式（2）计算脏器指数，称质量后贮藏于-80 ℃待进一步分析。

式中：

A——肝脏指数，%；

m1——肝脏质量，g；

m2——小鼠处死前体质量，g。

（4）脂肪指数

小鼠麻醉解剖，摘取脏器的同时，摘取附睾脂肪、肾周脂肪和棕色脂肪，称质量，按公式（3）计算脂肪指数，称质量后贮藏于-80 ℃待进一步分析。

式中：

B——脂肪指数，%；

m3——脂肪质量，g；

m2——小鼠处死前体质量，g。

1.2.5 数据分析

所有试验均重复3 次或以上。数据表示为平均值±标准差（SD）。使用SPSS 23.0 软件进行统计分析，P＜0.05 表示具有显著性差异。使用Prism 8.0.2制作图表。

2 结果与分析

2.1 云南野生PE鞣花酸、漆黄素定量分析

鞣花酸的标曲为：y=1E^7x+3 769.5，R²=0.999 8；漆黄素的标曲为：y=2E^7x+286 193，R²=0.998 4。图1 为云南野生PE 的HPLC 分析图谱，F1、F2 分别为鞣花酸和漆黄素，利用面积归一化法，计算得出PE 中鞣花酸含量为3 030.78 μg/g，漆黄素含量为560.70 μg/g。

图1 云南野生PE 的HPLC 分析图谱Fig.1 HPLC analysis profiles of Yunnan wild PE

2.2 PEE对3T3-L1细胞的影响

2.2.1 细胞毒性

如图2 所示，control 组为不加药物组，与其比较，PEE 作用质量浓度为10～200 μg/mL 时，3T3-L1细胞存活率无显著性差异（P＞0.05）；质量浓度达到500 μg/mL 时，细胞存活率显著下降至90.66%（P＜0.05）。研究表明，当细胞存活率＞90%，作用药物对细胞无毒害作用[12]。因此，PEE 在10～500 μg/mL作用质量浓度范围内对细胞无毒害作用，后续实验选择100、200、300 μg/mL 分别作为低、中、高剂量，分别记为PEE-L、PEE-M、PEE-H。

图2 PEE 对3T3-L1 细胞存活率的影响Fig.2 Effect of PEE extract on the survival rate of 3T3-L1 cell

2.2.2 PEE对3T3-L1细胞分化的影响

3T3-L1 细胞经过“鸡尾酒法”培养，能够在较短时间内分化成成熟的脂肪细胞[13]，在分化过程中细胞会产生“指环状”脂滴，这些脂滴能够与油红O 染液特异性结合，表示3T3-L1 细胞的分化情况[14]。如图3a～3d 所示，染色后，与control 组比较，PEE 干预的3T3-L1 细胞脂滴密度更低。利用异丙醇溶解结合的油红O 染液，于450 nm 测量其OD 值表示细胞产生的脂滴含量，发现PEE 组脂滴含量相对于control 组，呈浓度依赖性显著下降（图3e），300 μg/mL 质量浓度时，脂滴相对含量为92.67%。说明PEE 能够显著抑制3T3-L1 细胞分化，减少脂滴生成（P＜0.05）。

图3 PEE 对3T3-L1 细胞分化的影响Fig.3 Effect of PEE on differentiation of 3T3-L1 cell

2.2.3 PEE对成熟的3T3-L1细胞的影响

如图4a、b 所示，PEE 能够显著减少成熟的3T3-L1 细胞产生的TG、TC（P＜0.05），且都具有浓度依赖性。作用质量浓度为300 μg/mL 时，TG、TC 的相对含量分别为对照组的66.47%、40.87%，具有统计学意义（P＜0.05）。

图4 PEE 对成熟的3T3-L1 细胞产生TG、TC 的影响Fig.4 Effect of PEE on TG and TC production in mature 3T3-L1 cells

图5 EF 对HFD 小鼠血脂水平的影响Fig.5 Effect of EF on lipid levels in HFD mice

Woo 等[15]发现鞣花酸能够阻滞细胞在G0/G1 期来抑制细胞周期进程，同时在蛋白水平下调成脂标志物，减少脂肪堆积，成脂标志物的降低与TG 合成酶的下调密切相关。而漆黄素也被证实能够抑制3T3-L1 细胞前期的分化，并诱导Sirt1表达，抑制细胞中脂质积累，下调PPARγ的表达[16]。推测PEE具有良好的降脂活性与鞣花酸、漆黄素有关。为验证假设，将鞣花酸与漆黄素以5:1 的比例还原搭配成混合物EF，研究其对HFD 小鼠的影响。

2.3 EF对HFD小鼠的影响

2.3.1 EF对HFD小鼠体质量、摄食量的影响

如表2 所示，实验进行8 周后，HFD 小鼠体质量、增重极显著提高，分别是ND 小鼠的144.23%、281.68%，肥胖模型造模成功。而EF 干预的小鼠体质量虽然显著高于ND 小鼠（P＜0.05），但体质量是HFD 小鼠的84.96%～87.43%，增重是HFD 小鼠的71.67%～79.96%，具有显著性差异（P＜0.05），EF 能够有效抑制高脂饲料对小鼠体质量的增加，且各组小鼠摄食量无显著差异（P＞0.05），EF 不会抑制小鼠食欲。这与Huang 等[17]的研究结果相似，喂食了余甘子水提物的HFD 大鼠体质量也显著性低于HFD 大鼠，且饮食量无显著性差异。

表2 各组小鼠的体质量、摄食情况Table 2 Body weight and food intake of mice in each group

2.3.2 EF对HFD小鼠脂肪指数的影响

如表3 所示，与HFD 小鼠比较，EF 干预后，棕色脂肪指数（Brown Fat Index，BFI）显著增长（P＜0.05），低剂量干预的效果最佳，BFI 增长了43.75%。同时，EF 对抑制白色脂肪组织（White Adipose Tissue，WAT）堆积具有积极作用，低剂量干预的小鼠附睾脂肪指数（Epididymal Fat Index，EFI）、肾周脂肪指数（Perirenal Fat Index，PFI）显著性减小（P＜0.05），分别是HFD 小鼠的54.34%、57.31%。

表3 各组小鼠的脂肪指数Table 3 Fat index of mice in each group

WAT 是机体储存能量的主要器官，肥胖会使过多的能量以甘油三酯的形式在WAT 中过度沉积；而棕色脂肪组织（Brown Adipose Tissue，BAT）是机体的产热器官，在机体能量平衡中起着重要作用[18]。据报道，运动会诱导WAT 棕色化；机体产热时，BAT 会诱导WAT 脂解以提供能量物质，BAT 对减肥具有积极意义[19,20]。研究发现，喂食鞣花酸的HFD 大鼠的EFI 减少了12.97%，BFI 增长了65.79%[21]，与本实验结果相似。EF 能够减少HFD 小鼠的WAT 堆积，并增加BAT 的生成。

2.3.3 EF对高脂饮食小鼠血脂水平的影响

肥胖会导致血清TG、TC、LDL-C 含量上升、HDL-C 含量降低，进而引发高脂血症、T2DM、CVD等疾病。Kim 等[11]发现富含鞣花酸的红莓提取物主要是通过下调肝脏中成脂基因PPAR γ、C/EBP α、SREBP-1c等的表达，降低HFD 小鼠血清中的TC、TG、LDL-C 含量并提高 HDL-C 含量，以达到减肥降脂的目的。而富含漆黄素的漆树提取物则被证实能加快HFD 小鼠尾部毛细血管的血流速率，改善血液循环状态，减少肥胖带来的血管损伤[22]。

实验进行8 周后，与HFD 小鼠比较，EF 显著降低了高脂饮食小鼠血清的TG、TC、LDL-C 水平（P＜0.05），且具有浓度依赖性，高剂量作用时分别降低了45.48%、12.06%、37.54%。同时，高剂量EF 干预显著提高HDL-C 水平（P＜0.05），提高了18.75%。这说明EF 能有效改善高脂饮食引发的血脂水平紊乱。

2.3.4 EF对高脂饮食小鼠肝脏影响

肝脏指数常常被用于表征肝脏损伤，肥胖易导致甘油三酯淤积于机体肝脏中，导致肝脏肥大。如图6a 所示，HFD 小鼠肝脏指数显著高于ND小鼠（P＜0.05），而EF 中、高剂量干预后小鼠的肝脏指数显著小于HFD 小鼠（P＜0.05），都减少了8.07%，说明EF 能够改善高脂饮食导致的肝脏肿大现象。这与冯孔龙等[23]的实验结果相似，同是黄酮物质的川陈皮素可以减小HFD 大鼠的肝脏指数，比HFD 大鼠的肝脏指数小17.41%，效果与奥利司他无显性差异（P＞0.05）。

图6 EF 对HFD 小鼠肝脏的影响Fig.6 Effects of EF on liver of HFD mice

肥胖还会影响肝脏代谢功能，易引发炎症，使得肝细胞变形、坏死，细胞内的ALT 和AST 释放入血，导致血清中的转氨酶含量升高[24]，因此ALT 和AST 是肝细胞损伤的敏感指标。如图6b、c 所示，EF 干预的HFD 小鼠血清中的ALT 和AST 均呈浓度依赖性降低，虽然ALT 含量与HFD 小鼠无显著性差异（P＞0.05），但AST 含量显著下降（P＜0.05），并恢复至ND 小鼠水平，这进一步说明EF 能够修复高脂饮食导致的肝损伤，对预防和治疗肥胖相关的NAFLD 具有重要意义。

3 结论

本研究发现，云南野生PE 的黄酮多酚提取物PEE 能够显著抑制3T3-L1 细胞分化成脂肪细胞，并显著降低细胞的脂滴、TG、TC 含量（P＜0.05），云南野生PE 具有良好的降脂作用。而云南野生PE的黄酮多酚中，鞣花酸和漆黄素的比例约为5:1。按比例复配的鞣花酸和漆黄素混合物EF 在不影响HFD 小鼠食欲的前提下，能够显著抑制HFD 导致的体质量增加，并抑制WAT 堆积，促进BAT 生长（P＜0.05）；并能够改善高脂饮食导致的血脂紊乱、修复高脂饮食导致的肝脏损伤，改善肝脏肿大的现象。综上所述，云南野生余甘子中鞣花酸和漆黄素具有减肥降脂作用，这为充分开发利用余甘子资源提供了理论依据。