山西老陈醋通过JAK2/STAT3通路减轻高脂饮食诱导的大鼠肝损伤

刘佳佳，申彤，陈嘉，庞全海*

（1.山西农业大学动物医学学院，山西晋中 030801）（2.山西农业大学食品科学与工程学院，农产品贮藏保鲜研究所，山西太原 030031）

高脂血症在临床上是一种常见的体内脂质代谢紊乱性疾病，是多种心脑血管疾病的高危因素之一[1]。目前，中西药治疗高脂血症均有一定程度副作用，因此膳食辅助防治高脂血症就具有重要意义。山西老陈醋富含的黄酮类化合物、川芎嗪、多酚类化合物[2]、多糖、氨基酸[3]、类黑精等功能性成分，具有保健功能和药理作用[4,5]。研究表明，川芎嗪能抑制内源性胆固醇合成，改善血脂水平，缓解高脂血症症状[6,7]；黄酮类物质可显著降低高脂血症大鼠血清和肝脏中甘油三酯水平，抑制并清除体内自由基的产生和脂质过氧化反应，保护肝脏组织[8,9]。进一步研究证实山西老陈醋具有降低机体总胆固醇和甘油三酯水平、调节血脂、保护肝脏等功能[10]。JAK/STAT 信号通路是多种细胞因子信号转导的共同通路之一，JAK2 和STAT3 作为该家族中的重要成员，在信号转导过程中发挥着重要作用[11]。研究表明，JAK2/STAT3 信号通路参与机体胆固醇、甘油三酯及脂肪酸的脂代谢[12,13]。Hu 等[14]报道JAK/STAT 通路可介导机体的组织修复和脂肪生成等生命活动。Zhang 等[15]在齐墩果酸对高脂血症疾病的临床试验中证实，齐墩果酸通过干扰TYK2-STAT1/3 信号传导通路的激活，显著降低了STAT3二聚体的形成，进而抑制STAT3 表达。虽然目前大量研究已证实，JAK2/STAT3 信号通路可调控高脂血症，但山西老陈醋是否通过JAK2/STAT3 信号通路减轻高脂饮食诱导大鼠的肝损伤尚无文献报道。

基于此，本试验利用高脂乳剂灌胃法建立高脂饮食诱导大鼠模型，不同剂量山西老陈醋对高脂饮食诱导大鼠灌胃治疗，进而探究山西老陈醋通过JAK2/STAT3 信号通路减轻高脂饮食诱导大鼠肝损伤的作用机制，为后期进一步研究其靶向作用机制提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

30 只SPF 级6 周龄雄性Wistar 大鼠，许可证号：SCXK（京）2019-0010，斯贝福生物技术有限公司，经山西农业大学试验动物伦理委员会审查，试验动物使用方案符合动物试验伦理要求。

1.1.2 试验主要试剂

紫林老陈醋，山西紫林醋业股份有限公司；玉米胚芽油，山东西王食品有限公司；胆固醇（C8280）、吐温-80（T8360）、丙基硫氧嘧啶（P7161）、胆酸钠（C1291697）、总RNA 提取试剂盒（R1200）、通用SP检测试剂盒（SP0041）、Goat Anti-Rabbit IgG Antibody（SE134）、Goat Anti-Rat IgG Antibody（SE132）均购于Solarbio；总胆固醇（Total Cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（High-Density Lipoprotein Cholesterol，HDL-C）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽还原酶（Glutathione Reductase，GRx）、总抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）、谷草转氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALK-P）测试盒均购于南京建成生物工程有限公司；Rabbit Anti-GAPDH Antibody（bsm-33033M）、Mouse Anti-GAPDH Antibody（bs-2188R）、Rabbit Anti-JAK2 Antibody（bs-0908R）、Rabbit Anti-STAT3 Antibody（bs-55208R）均购于北京博奥森生物有限公司；荧光定量试剂盒（MF013）购于北京聚合美生物科技有限公司等。

1.2 试验方法

1.2.1 不同剂量山西老陈醋的配制

按体质量计2.7 g/kg 剂量组为原醋组；将原醋2 倍稀释（1/2 原醋）即为按体质量计1.35 g/kg 剂量组；恒温50 ℃下，使用恒温磁力搅拌器将原醋2 倍浓缩（2 倍原醋）即为按体质量计5.4 g/kg 剂量组[16]。

1.2.2 构建高脂饮食诱导大鼠模型

按照比例：体积分数60%吐温-80+体积分数15%玉米胚芽油+体积分数6%胆固醇+体积分数2%胆酸钠+体积分数0.2%丙基硫氧嘧啶+体积分数水16.8%，配制高脂乳剂[17]。按每天10 mL（按kg 体质量计）高脂乳剂给予大鼠灌胃，构建高脂饮食诱导大鼠模型，持续灌胃5 周。

1.2.3 动物分组与处理

预饲1 周后，随机分为5 组（n=6）：健康对照组（C）、高脂饮食诱导组（M）、按体质量计1.35 g/kg剂量山西老陈醋灌胃M 组（LV）、按体质量计2.7 g/kg剂量山西老陈醋灌胃M 组（MV）和按体质量计5.4 g/kg 剂量山西老陈醋灌胃M 组（HV）。室温下，各试验组大鼠自由饮水、自由采食基础饲料，试验组灌胃高脂乳剂5 周，同时不同剂量（按每只2.0 mL/d）山西老陈醋灌胃10 周，C 组灌服等量生理盐水，每周称重1 次并记录，试验时间共10 周。

第10 周试验结束后，禁食16 h，乙醚麻醉，腹主动脉采血2 mL，4 ℃,2 500 r/min 离心10 min，取上清，-80 ℃保存。大鼠颈椎脱臼处死后，取相同位置肝脏组织，质量分数4%的多聚甲醛中固定，肝脏剩余组织液氮冻存。

1.2.4 不同试验组大鼠血清学检测

按照脂质、抗氧化活性、肝功能不同指标试剂盒操作说明，在酶标仪中检测各组大鼠血清TC、TG、HDL-C、SOD、GRx、T-AOC、AST、ALT、ALK-P 水平。数据结果采用Excel 整理后GraphPad Prism 8.0.2 软件进行分析。

1.2.5 不同试验组大鼠肝脏病理学检测

取固定的肝脏组织，常规石蜡包埋切片，经苏木素-伊红（HE）染色后，置于光学显微镜下观察各组大鼠肝脏病理学形态变化并进行分析。

1.2.6 不同试验组大鼠肝脏中JAK2/STAT3通路mRNA水平表达检测

根据NCBI GenBank 已登录的大鼠GAPDH、JAK2、STAT3 序列，利用Primer 3 plus 设计3 对特异性引物，委托上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

取冻存的肝脏组织充分研磨后，加入裂解液提取总RNA，测定RNA 浓度和纯度。相对荧光定量法（q-PCR）检测各组大鼠肝脏中JAK2、STAT3mRNA水平表达，根据荧光定量试剂盒说明书，构建反应体系（20 μL）：2×Realtime PCR Super mix 10 μL、cDNA 模板2.0 μL、正反向引物各0.5 μL、ddH2O 7.0 μL。反应程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40 个循环，72 ℃ 5 min，每个样本重复3 次。2-ΔΔct法计算各组大鼠肝脏中JAK2、STAT3 mRNA 水平表达。

取不同试验组大鼠肝组织，研磨后加入裂解液，14 000 r/min 离心5 min，BCA 试剂盒测定所提蛋白浓度。蛋白上样量为80 ng，100 ℃沸水使蛋白变性，利用SDS-PAGE 凝胶电泳分离总蛋白，质量分数5%的浓缩胶80 V 20 min，质量分数10%的分离胶120 V 90 min。湿转法恒流200 mA 60 min 将蛋白转移至NC 膜。用质量分数5%的脱脂奶粉室温摇床封闭2 h，TBST 洗膜5 min/次×3 次。抗体稀释液分别稀释Mouse Anti-GAPDH Antibody（1:5 000）、Rabbit Anti-JAK2（1 : 250）、Rabbit Anti-STAT3 Antibody（1:200），4 ℃孵育12～14 h。分别加入二抗Goat Anti-Rat IgG Antibody（1:15 000）、Goat Anti-Rabbit IgG Antibody（1:15 000），室温孵育1 h。TBST 充分清洗，ECL Plus 超敏发光液显色，凝胶成像分析仪曝光显影，Image J 软件进行灰度值分析。

1.2.8 不同试验组大鼠肝脏中JAK2/STAT3通路定位分析

取已包埋脱水透明后的各组大鼠肝脏切片，烘干后，经过脱蜡脱水，柠檬酸钠抗原修复液修复，质量分数3%的H2O2室温处理10 min，山羊血清封闭液37 ℃封闭20 min，分别滴加抗体稀释液稀释的Rabbit Anti-JAK2 Antibody（1:50）、Rabbit Anti-STAT3 Antibody（1:50），阴性对照组滴加等量PBS，4 ℃ 12 h，室温下复温30 min，PBS 漂洗3 次，滴加HRP 标记二抗37 ℃孵育30 min，PBS 漂洗3 次，滴加链霉亲和素37 ℃孵育30 min，PBS 漂洗4 次，DAB 显色5 min，蒸馏水漂洗，苏木素轻度复染30 s，镜检，Image-Pro Plus 6.0 进行平均光密度值分析。

1.3 数据分析

采用GraphPad Prism 8.0.2 软件对数据结果作单因素方差分析，试验结果表示为平均值±标准偏差（SD）。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 不同试验组大鼠体质量和血清学指标检测

2.1.1 不同试验组大鼠每周平均体质量统计结果

不同试验时间各组大鼠平均体质量结果显示（图1），C 组大鼠体质量11 周时为595.22 g，与第一周比增长了64.26%，M 组大鼠11 周时体质量488.78 g，HV、MV、LV 组大鼠11 周时体质量分别为415.60、427.40、447.57 g，C 组总体极显著高于其他试验组（P＜0.01）。M 组和不同剂量灌胃组大鼠1～6 周体质量增长缓慢，6～11 周持续增长；M组大鼠1～6 周体质量增长25%，HV、MV、LV 组大鼠1～6 周体质量分别增长38.01%、33.23%、31.47%；M 组大鼠6～11 周体质量增长40.88%，HV、MV、LV 组大鼠6～11 周体质量分别增长18.82%、26.13%、29.71%，M 组与不同剂量灌醋组大鼠体质量差异无统计学意义，推测是灌胃过程和后期脂肪肝形成会影响大鼠摄食量[18]。

图1 各组大鼠每周平均体质量统计结果Fig.1 Statistical results of the mean weekly body weight of rats in each group

2.1.2 不同试验组大鼠血清脂质检测

学生可以自主选择实验内容（背景图），可以平面密铺，也可以立体架构。学生从“智慧珠”的不同研究兴趣出发，自主选择实验内容结伴研究，从而形成个性化的实验结果。通过合作交流、动手实践、思维碰撞后，感悟得出属于个人的见解。数学实验的主要价值在于促进学生数学活动经验的累积，让学生在“做中学”，通过实物操作培养学生的多种能力。任务是真实而复杂的，需要学生付出努力，自我反思，需要不断地尝试、判断、调整。在操作过程中，学生的分析、实践、创新思维都得到了锻炼，高阶思维在动手操作中得以提升。

高脂血症在临床上常表现为血清HDL-C 降低或TC 和TG 升高[19,20]。本试验脂质检测结果显示（表2），与C 组相比，M 组TC、TG 极显著升高（P＜0.01），分别升高70.12%、28.74%，HDL-C 极显著降低53.85%（P＜0.01）。说明本研究成功构建高脂饮食诱导大鼠模型。刘兰涛等[10]试验证明饲喂山西老陈醋醋泥冻干粉的高脂饮食小鼠，TC 和TG 显著降低及HDL-C 显著升高。本研究结果显示与M 组相比，HV、MV、LV 组TC、TG（极）显著降低（P＜0.05，P＜0.01），HDL-C（极）显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；其中HV 组TC、TG 降低20.50%、48.65%，HDL-C 升高41.24%，证明不同剂量的山西老陈醋均可以降低血清中脂质水平[21]。与LV 组相比，HV 组TC、TG 极显著降低26.46%、12.32%，HDL-C 极显著升高19.90%（P＜0.01）；MV 组与LV 组比，TC、TG（极）显著降低23.27%和8.25%（P＜0.05，P＜0.01），HDL-C 极显著升高12.76%（P＜0.01）；与MV 组相比，HV 组的HDL-C 显著升高8.19%（P＜0.05），TC 和TG 无显著差异。说明高、中剂量的山西老陈醋降低血清脂质效果最好[22]。

表2 大鼠血清脂质检测结果Table 2 Serum lipid test results of rats (±s)

表2 大鼠血清脂质检测结果Table 2 Serum lipid test results of rats (±s)

注：A～E 表示差异极显著（P＜0.01），a～e 表示差异显著（P＜0.05），同一列上标不含相同字母表示有差异，字母相同表示无显著性差异，下同。

2.1.3 不同试验组大鼠血清抗氧化活性检测

现代科学研究表明，山西老陈醋中多种生物活性物质发挥抗氧化功效[23]。本试验抗氧化活性结果显示（表3），与C 组相比，M 组SOD、GRx、T-AOC 极显著降低（P＜0.01），分别降低32.16%、48.78%、20.17%。与M 组相比，HV、MV、LV 组SOD 极显著升高19.51%、10.68%、7.41%（P＜0.01）；T-AOC（极）显著升高3.99%、10.56%、6.19%（P＜0.05，P＜0.01）；GRx（极）显著升高40%、38.24%、19.23%，说明不同剂量的山西老陈醋均可以提高大鼠血清抗氧化活性[24]。与LV 组相比，HV 组SOD 和GRx 极显著升高13.07%和51.92%（P＜0.01），T-AOC 无显著差异；MV 组GRx 和T-AOC（极）显著升高49.70%和4.65%（P＜0.05，P＜0.01）。与MV 组相比，HV 组SOD 极显著升高9.89%（P＜0.01），结果表明高剂量山西老陈醋对提高由高脂饮食诱导大鼠的抗氧化活性效果最好。

表3 大鼠血清抗氧化活性检测结果Table 3 Test results of serum antioxidant activity in rats (±s)

表3 大鼠血清抗氧化活性检测结果Table 3 Test results of serum antioxidant activity in rats (±s)

2.1.4 不同试验组大鼠血清肝功能检测

山西老陈醋中多酚和黄酮类物质可提高肝组织的抗氧化酶活性，促进肝脏排毒，修复肝脏组织损伤，降低血清中ALT 和AST 活性[25,26]。本试验肝功能结果显示（表4），与C 组相比，M 组AST、ALT 极显著升高37.22% 和35.37%（P＜0.01），ALK-P 极显著降低38.37%（P＜0.01）。与M 组相比，HV、MV、LV 组AST 极显著降低32.79%、29.07%、13.85%，ALT 极显著降低21.65%、20.67%、14.79%，ALK-P 极显著升高19.42%、19.71%、10.64%（P＜0.01）。结果表明不同剂量的山西老陈醋均可以改善高脂饮食所致的肝功能受损，与阳飞等[27]报道结果一致。与LV 组相比，HV 组和MV 组AST 极显著降低21.99%和17.67%，ALK-P 极显著升高9.83%和10.16%（P＜0.01）；与MV 组相比，HV 组AST 极显著降低5.25%（P＜0.01），数据结果表明，高剂量山西老陈醋对高脂饮食诱导大鼠的肝功能改善能力强于其他剂量组。

表4 大鼠血清肝功能检测结果Table 4 Serum liver function test results of rats (±s)

表4 大鼠血清肝功能检测结果Table 4 Serum liver function test results of rats (±s)

2.2 不同试验组大鼠肝脏病理学检测结果

肝脏病理学检测结果显示（图2），C 组肝细胞结构完整，大小均一，细胞核形态规则且排列整齐；与C 组比，M 组肝细胞内有大量明显的脂滴空泡，细胞核被挤压偏移向一侧；说明高脂血症模型构建成功。与M 组相比，不同剂量灌醋组肝脏细胞中脂滴空泡明显减少，肝细胞形态趋于正常；与LV 组相比，MV 组和HV 组肝细胞结构明显完整，肝细胞内脂滴明显减少。说明不同剂量山西老陈醋均可改善肝脏组织的病变，且高剂量改善效果最优。

图2 不同试验组大鼠肝脏HE 染色（×40）Fig.2 The liver of rats in different experimental groups was stained with HE (×40)

2.3 不同试验组大鼠肝脏中JAK2/STAT3 mRNA水平表达

大量试验证明，JAK2/STAT3 通路在肝损伤疾病进程中发挥重要的作用，JAK/STAT 信号通路的异常表达可导致多种肝损伤[28,29]。有试验证明，通过抑制JAK2/STAT3 信号通路的激活，可有效减缓CCl4 或乙酰氨基酚诱导的大鼠急性肝损伤[30,31]。赵娜等[32]研究表明黄酮类物质可通过抑制JAK2/STAT3 信号通路减轻肝组织的病理损伤。本试验q-PCR 结果显示（图3），与C 组相比，M组JAK2/STAT3 mRNA 水平表达极显著升高87.87%和88.00%（P＜0.01）；与M 组相比，HV、MV、LV组JAK2/STAT3 mRNA水平表达极显著降低（P＜0.01），JAK2 mRNA 水平表达降低至2.17、3.34、5.06，STAT3mRNA 水平表达降低至2.63、3.44、5.87；与LV组相比，HV 组JAK2/STAT3mRNA 水平表达极显著降低57.07%和55.19%（P＜0.01），MV 组JAK2/STAT3 mRNA 水平表达极显著降低34.02%和41.45%；与MV 组相比，HV 组JAK2/STAT3 mRNA 水平表达（极）显著降低34.93%和23.47%（P＜0.05，P＜0.01）。数据结果表明了山西老陈醋通过抑制JAK2/STAT3通路中JAK2 和STAT3 mRNA 水平表达来改善高脂饮食诱导的肝损伤，且高剂量山西老陈醋抑制效果最好。

图3 各组大鼠肝脏中JAK 2 和STAT 3 mRNA 相对表达量Fig.3 Relative expression of JAK2 and STAT3 mRNA in liver of rats in each group

2.4 不同试验组大鼠肝脏中JAK2/STAT3蛋白水平表达

Western Blotting 结果显示（图4），与C 组相比，M 组JAK2、STAT3 蛋白水平表达极显著升高（P＜0.01），分别上升68.73%和58.44%；与M组相比，不同剂量灌醋组JAK2、STAT3蛋白表达极显著降低（P＜0.01）；其中HV、MV、LV组JAK2蛋白表达分别降低63.75%、59.32%、56.68%，STAT3蛋白表达分别降低57.37%、55.97%、52.89%。结果揭示了不同剂量的山西老陈醋可以通过抑制JAK2、STAT3蛋白表达水平，进而减轻高脂饮食诱导大鼠的肝损伤疾病。与LV组相比，HV组JAK2和STAT3蛋白表达极显著降低16.33%和9.51%（P＜0.01），MV组（极）显著降低6.10%和6.50%（P＜0.05，P＜0.01）。与MV组相比，HV组JAK2蛋白表达显著降低10.90%（P＜0.05），STAT3蛋白表达无显著差异。结果表明高、中剂量的山西老陈醋抑制JAK2、STAT3蛋白表达效果强于低剂量灌醋组。

图4 各组大鼠肝脏中JAK2、STAT3 蛋白相对表达量Fig.4 The relative expression of JAK2 and STAT3 protein in the liver of rats in each group

2.5 不同试验组大鼠肝脏中JAK2/STAT3定位分析

免疫组化结果显示（图5），不同试验组大鼠肝脏细胞核与细胞质中均检测到JAK2、STAT3 蛋白阳性表达。与C 组相比，M 组JAK2、STAT3 表达极显著升高46.89%和74.71%（P＜0.01）。与M 组相比，不同剂量灌醋组JAK2、STAT3 表达（极）显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；HV、MV、LV 组JAK2 表达降低42.94%、39.93%、20.87%，HV、MV、LV 组STAT3 表达降低60.98%、57.24%、41.71%。与LV组相比，HV 组JAK2 和STAT3 表达降低27.89%和33.06%（P＜0.01），MV 组降低24.09%和26.64%。与MV 组相比，HV 组STAT3 表达极显著降低5.75%（P＜0.01），JAK2 表达无显著差异。试验结果进一步证明了山西老陈醋通过抑制JAK2/STAT3 通路来实现对肝损伤的保护作用。

3 结论

本研究通过血清学检测不同试验组大鼠血清血脂含量、抗氧化和肝损伤水平。发现模型组TC、TG 含量极显著升高，证明高脂饮食诱导高脂血症模型构建成功。不同剂量灌醋组均可改善高脂饮食诱导大鼠的血脂、抗氧化和肝损伤水平，按体质量计2.7 和5.4 g/kg 剂量灌醋组AST、ALT 极显著降低，ALK-P、SOD、GRx、T-AOC 极显著升高，肝脏病变程度减轻，肝细胞内脂滴明显减少，改善效果显著优于按体质量计1.35 g/kg 剂量灌醋组，表明浓度为按体质量计2.7～5.4 g/kg 的山西老陈醋改善效果最佳。不同剂量山西老陈醋均可抑制肝脏中JAK2/STAT3 mRNA 和蛋白水平表达，按体质量计2.7 和5.4 g/kg 剂量的山西老陈醋作用效果最为显著，提示山西老陈醋可能通过抑制JAK2/STAT3 信号通路的激活，进而减轻高脂饮食引发的肝损伤。本研究可为山西老陈醋在防治高脂血症疾病的发生及靶向调控JAK2/STAT3 通路提供一定的理论依据，也为山西老陈醋的综合开发与利用提供科学依据。