蓝莓黑醋栗枸杞决明子复合物对眼部细胞氧化应激损伤的保护作用

王欢，王敏，刘竹青，何运辉，石举然，邹圣灿

（青岛琛蓝健康产业集团有限公司，山东青岛 266000）

眼部是人体感受与传递外界信息的初始媒介，由于代谢旺盛，导致其容易遭受一系列氧化影响，出现氧化应激现象[1,2]。氧化应激表现为细胞氧化与抗氧化作用失衡的机体状态，即当机体活性氧水平过高时，脂质与蛋白质等生物大分子自动启动链式反应，细胞活动中断，导致的眼部视觉功能障碍症状[3,4]。已有研究表明[5-7]，外源性抗氧化剂对眼部氧化应激损伤具有保护作用。

一些天然来源的产物被证实可保护眼部氧化应激损伤，其中蓝莓、黑醋栗、枸杞、决明子最具代表性[8-10]。蓝莓花色苷为蓝莓主要活性成分，具有保护眼部氧化应激损伤作用。张卓睿等[11]研究发现，蓝莓花色苷可显著减低血乳酸及丙二醛的含量。除此之外，蓝莓花色苷也可以显著增强超氧化物歧化酶与谷胱甘肽过氧化物酶的活力，抑制下游产物NF-kB 的大量生成，实现防止氧化损伤的作用[12]。黑醋栗，被广泛应用于食品、医药与保健品中。黑醋栗的活性物质花色苷可以在脱氢化作用下与自由基结合，终止自由基链式反应；也可与金属催化剂通过螯合反应抑制过氧化现象[13]。枸杞与决明子为国家卫健委批准的药食同源。《本草纲目》中对枸杞的记载为：“补肾生精，养肝，明目安神”。枸杞多糖能显著提升酶促抗氧化体系酶活力，抑制过氧化产物丙二醛生成与积累，使得机体氧化速度与程度显著降低，缓解眼部氧化应激损伤[14,15]。《神农本草经》中对决明子的记载为“久服益精，轻身”。决明子中蒽醌类可通过三条途径实现眼部氧化应激损伤保护作用：抑制眼部晶状体细胞中醛糖还原酶的活性；抑制氧化糖基化末端产物的生成；抑制视网膜细胞中氧化DNA 改性及亚硝基酪氨酸积累[16,17]。

虽然大量研究已经明确了4 种天然产物的眼部氧化应激保护作用机理，但缺乏对天然产物作为保护眼部氧化应激活性功能食品的产业化开发。此外，4 种具有眼部氧化应激保护活性的天然产物安全性及眼部氧化应激保护作用效果仍旧未知。因此为进一步将理论研究转化实际生产，本试验选择蓝莓、黑醋栗、枸杞及决明子提取物为原料（主要成分为花色苷、多糖及蒽醌），复配白砂糖及食用香精，制备营养复方制剂——蓝莓黑醋栗枸杞决明子复合物（Blueberry，Blackcurrant，Medlar，Cassia Seed Complex，LHGJ）。之后通过丙酮醛（Methylglyoxal，MGO）诱导人视网膜色素上皮细胞（Retinal Pigment Epithelium，APRE-19）氧化应激损伤建立细胞模型，并给与不同质量浓度蓝莓黑醋栗枸杞决明子复合物处理。采用荧光显微镜检测细胞活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）含量、采用酶联免疫法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISE）测定一氧化氮（Nitric Oxide，NO）含量、采用比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px)活力及采用羟胺法测定超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活力。研究LHGJ 复合物对眼部细胞氧化应激损伤的作用，以期为LHGJ 复合物的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

蓝莓、黑醋栗提取物（规格30:1），西安晋恒化工有限公司；黑枸杞、决明子提取物：（规格30:1），陕西嘉禾有限公司；矢车菊素 -3-O-葡萄糖苷标准品（色谱级），上海甄淮生物科技有限公司；葡萄糖（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；APRE-19 细胞，中国上海科学院细胞库；DMEM/F12（Dulbecco,s Modified Eagle Media：Nutrient Mixture F-12，DMEM/F12）1:1 细胞培养液，美国GIBCO公司；胎牛血清（分析纯），四季春生物公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）试剂盒，日本同仁化学研究所；ROS 检测试剂盒（2,7-dichlorofluorescin diacetate），美国Abcam 公司；SOD、NO、GSH-Px试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.1.2 仪器与设备

Thermo Fisher Multiskan FC 酶标仪，上海赛默飞世尔仪器有限公司；L-500 离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；Advantage 超纯水仪，德国Merck Millipore 公司；BSA224S-WC 电子天平（精密度0.000 1），赛多利斯贸易有限公司；MODEL C-SHG1荧光显微镜，上海尼康仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 LHGJ复合物的制备

蓝莓、黑醋栗、枸杞与决明子提取物过100 目筛，之后按照蓝莓提取物5.50 g/100 g、黑醋栗提取物10.00 g/100 g、枸杞提取物36.50 g/100 g、决明子提取物45.50 g/100 g、白砂糖2.48 g/100 g、葡萄香精0.02 g/100 g 的标准，进行称取，混合均匀，分装每袋4.50 g，可得成品。

1.2.2 LHGJ复合物总花色苷、粗多糖及蒽醌含量测定

1.2.2.1 pH值示差法测定总花色苷含量

参考Wang 等[18]的方法并稍作调整。LHGJ 复合物经体积分数0.1%盐酸的甲醇溶液溶解并配置为1 mg/mL 的溶液，之后采用紫外分光光度计对LHGJ 复合物进行全波长测定（200～1 200 nm），确定最大吸收波长为516 nm。LHGJ 复合物溶液分别采用pH 值4.5 缓冲液（1 mol/L CH3COONa溶液、1 mol/L HCl 溶液与H2O 以100:60:90（V:V:V）的比例进行配制）与pH 值1.0 缓冲液（0.2 mol/L KCl 溶液与0.2 mol/L HCl 溶液以25:67（V:V）的比例进行配制）稀释100 倍，37 ℃平衡1 h，紫外分光光度计测定LHGJ 复合物于516 nm 处吸光度，利用700 nm 处吸光度进行校正，总花色苷含量按照式（1）计算：

式中：

F——总花色苷含量，mg/g；

A——pH 值1.0 缓冲液稀释后于516 nm 处所测得吸光度；

B——pH 值1.0 缓冲液稀释后于700 nm 处所测得吸光度；

a——pH 值4.5 缓冲液稀释后于516 nm 处所测得吸光度；

b——pH 值4.5 缓冲液稀释后于700 nm 处所测得吸光度；

ε——矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26900 L/(mol·cm)；

L——光程，1 cm；W 为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2 g/mol；

D——稀释倍数；

V——总提取液体积，L；

M——样品质量，g。

1.2.2.2 苯酚硫酸法测定LHGJ复合物粗多糖含量

根据《保健食品功效成分检测方法》[19]对LHGJ复合物中粗多糖含量进行测定。以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，样品经溶解后依次加入浓硫酸与体积分数6%的苯酚，剧烈晃动，待反应完全，测定490 nm 处吸光值。

1.2.2.3 醋酸镁-甲醇法测定LHGJ复合物蒽醌含量

称取LHGJ 复合物1 g 于烧瓶中，加入50 mL氯仿进行85 ℃水浴回流2 h，之后挥发干氯仿，加入0.5%醋酸镁-甲醇进行溶解，之后采用质量分数0.5%醋酸镁-甲醇法[20]对LHGJ 复合物蒽醌含量进行测定。

1.2.3 分组及药物处理

1.2.3.1 APRE-19细胞培养

APRE-19 细胞经液氮罐取出后，转移至培养于10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 g/L 链霉素的DMEM/F12 培养基中，放入37 ℃，体积分数5%CO2恒温细胞培养箱中培养，进行细胞复苏。每天对培养液进行更换至APRE-19 细胞生长至细胞融合度90%左右，对其进行传代处理，选取对数期生长细胞进行后续试验。

1.2.3.2 MGO及LHGJ复合物对APRE-19细胞活力的影响

取对数生长期的APRE-19 细胞，分为对照组与MGO 组、LHGJ 复合物组，以每孔1×104个细胞的标准接种96 孔板，接种24 h 后弃去完全培养基。对照组APRE-19 细胞中加入无血清培养基，MGO 组APRE-19 细胞中分别加入0.25、0.50、1、2、4 mmol/L MGO 溶液，LHGJ 复合物组APRE-19 细胞中分别加入0.01、0.1、1、10、100 μg/mL LHGJ 复合物溶液，孵育18 h。

1.2.3.3 LHGJ复合物对MGO诱导APRE-19细胞活力的影响

取对数生长期的APRE-19 细胞，分为对照组、MGO 组、MGO+0.01 μg/mL LHGJ 组、MGO+0.10 μg/mL LHGJ 组、MGO+1.00 μg/mL LHGJ 组、MGO+10.00 μg/mL LHGJ 组，以每孔1×104个细胞的标准接种96 孔板，接种24 h 后弃去完全培养基。对照组与MGO 组APRE-19 细胞中加入无血清培养基，MGO+不同质量浓度LHGJ 组的APRE-19细胞中分别加入0.01、0.10、1.00、10.00 μg/mL LHGJ 复合物溶液，孵育6 h 后，MGO 组与MGO+不同质量浓度LHGJ 组继续加入MGO。使MGO 最终浓度为0.08 mmol/L，孵育18 h。

1.2.4 CCK-8检测细胞活力

取对数生长期的APRE-19 细胞，按照1.2.3.2与1.2.3.3 分组以每孔1×104个细胞的标准接种96孔板。培养24 h 后，加入CCK-8 试剂（CCK-8:无血清培养基=1:9）100 μL，孵育3 h，测定450 nm处吸光度值，并计算细胞活力。

1.2.5 细胞氧化应激水平检测

1.2.5.1 ROS含量测定

参考甘婧[21]的方法，并稍作调整。APRE-19细胞经磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer，PBS）洗涤后，加入最终浓度为10 μmol/L 活性氧荧光探针（2,7-dichlorofluorescin Diacetate，DCFH-DA），37 ℃黑暗处孵育30 min 后进行无血清细胞培养液洗涤去除多余探针，荧光显微镜参数设置为激发波长485 nm与发射波长528 nm，观察ROS 荧光强度。

1.2.5.2 NO含量、GSH-Px及SOD活力测定

根据试剂盒说明书，对APRE-19 细胞裂解液采用羟胺法测定SOD 活力，采用ELISE 法测定NO含量，采用比色法测定GSH-Px 活力。

1.2.6 数据分析

采用SPSS 20.0 软件对试验数据进行统计分析，采用Origin 2020 进行绘图。以t检验进行显著性分析，P＜0.05 差异性显著，P＜0.01 差异性极显著，P＜0.001 差异性高度显著。试验重复3 次，数据以平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 总花色苷、粗多糖与蒽醌含量的测定

蓝莓与黑醋栗中的花色苷及枸杞与决明子中的多糖是LHGJ 复合物主要的活性物质。因此本研究对100 g LHGJ 复合物中总花色苷与多糖含量进行测定。由表1 可知，3 次提取工艺中每100 g LHGJ复合物总花色苷含量为2.01 g/100 g，总多糖含量为22.69 g/100 g，蒽醌含量为0.99 g/100 g。且均无显著性差异（P＞0.05）。

表1 总花色苷、粗多糖与蒽醌含量Table 1 Total anthocyanins,crude polysaccharides and anthraquinone content

2.2 APRE-19细胞活力

2.2.1 LHGJ复合物对APRE-19细胞活力的影响

根据APRE-19 细胞活力对LHGJ 复合物安全质量浓度进行筛选，结果如图1 所示，0、0.01、0.10、1.00、10.00 μg/mL LHGJ 复合物对APRE-19 细胞存活率的影响不具有显著性（P＞0.05），表明0～10.00 μg/mL LHGJ对APRE-19 细胞不具有毒性作用。当100.00 μg/mL LHGJ 复合物对APRE-19 细胞进行处理时，APRE-19细胞存活率下降15.43%，呈现高度显著性（P＜0.001），APRE-19细胞毒性作用明显。因此，选取0.01、0.10、1.00、10.00 μg/mL 进行细胞试验。

图1 LHGJ 复合物质量浓度对APRE-19 细胞活力的影响Fig.1 Effects of different mass concentrations of LHGJ complex on the viability of APRE-19 cells

2.2.2 MGO对APRE-19细胞活力的影响

根据APRE-19 细胞活力对MGO 诱导浓度进行筛选，结果如图2 所示。APRE-19 细胞活力抑制率随MGO 浓度的增加呈现明显上升，通过GraphPad Prism 6.0 软件进行曲线拟合，得到MGO 作用APRE-19 细胞半数抑制浓度为0.77 mmol/L，考虑到具体实验操作，选择浓度为0.80 mmol/L 的MGO对APRE-19 细胞进行诱导建立细胞损伤模型。

图2 MGO 浓度对APRE-19 细胞活力的影响Fig.2 Effects of different concentrations of MGO on the viability of APRE-19 cells

2.2.3 LHGJ复合物对MGO诱导APRE-19细胞活力的影响

MGO 诱导APRE-19 细胞经0.01、0.10、1.00、10.00 μg/mL LHGJ 复合物处理后，细胞存活率见图3。与MGO 组相比，LHGJ 各质量浓度组均能提高APRE-19 细胞活力，具有统计学意义。其中0.01 μg/mL 质量浓度提高效果具有显著性（P＜0.05），10 μg/mL 质量浓度具有极显著性（P＜0.01），0.10 与1.00 μg/mL质量浓度提高效果具有高度显著性（P＜0.001），分别提高21.23%与23.03%。说明LHGJ 复合物对氧化应激损伤APRE-19 细胞活力具有有效的保护作用。

图3 LHGJ 复合物质量浓度对MGO 诱导APRE-19细胞活力的影响Fig.3 Effects of LHGJ complex at different mass concentrations on MGO-induced viability of APRE-19 cells

2.3 LHGJ复合物对MGO诱导APRE-19细胞抗氧化能力的影响

2.3.1 LHGJ复合物对MGO诱导APRE-19细胞ROS生成量的影响

机体可接受含量范围内的ROS 对于维持生理正常活动有重要作用。但机体氧化应激状态时，ROS大量释放至超过机体可抵御含量时，细胞出现氧化损伤。荧光探针DCFH-DA 穿过细胞膜后，在细胞内酯酶作用下水解为DCFH，细胞内积累的ROS 氧化无荧光状态DCFH 为绿色荧光，因此，通过检测绿色荧光强度反映细胞内ROS 生成量，结果为图4 所示。与对照组相比，MGO 干预能显著增加ARPE-19 细胞氧化应激水平，细胞中ROS 的荧光强度增大为对照组的2.89 倍，具有显著性差异（P＜0.05）。与MGO 组对比，除1.00 μg/mL组LHGJ 复合物外，其余各组均能显著降低ARPE-19 细胞中ROS 的荧光强度（P＜0.05），具体表现为0.01、0.10、10.00 μg/mL LHGJ 复合物组细胞中ROS 的荧光强度分别降低为MGO 组的1.02、1.28、2.37 倍。说明一定剂量质量浓度的LHGJ 复合物可抑制体内ROS 的生成，从而达到对眼部细胞氧化应激现象的保护作用。徐文流等[22]等将枸杞、决明子、桑葚等进行复配，发现1 mg/kg 复合物可以降低ROS 水平25.62%，这与本文研究一致。此外，目前没有研究过4 种物质复合物对ROS 生成的作用，但有研究表明单独的蓝莓与黑醋栗花色苷、枸杞多糖、决明子蒽醌均可通过下调炎症因子基因的表达或增强抗氧化酶系活性，降低细胞内ROS 水平[23-26]。因此推测LHGJ 复合物可通过不同的分子机制降低细胞ROS 的生成，达到保护细胞氧化应激的作用。

2.3.2 LGHJ复合物对MGO诱导APRE-19细胞NO含量、GSH-Px与SOD活力的影响

机体的氧化应激现象是指抗氧化酶系统接受氧化刺激信号后，通过自我调整与修复，减少对细胞的氧化损伤[27]。为了进一步探讨LHGJ 复合物对MGO 诱导APRE-19 细胞抗氧化能力的影响，对APRE-19 细胞NO 含量、GSH-Px 及SOD 的活性进行检测。由图5a所知，与空白组相比，MGO 诱导能明显促进ARPE-19细胞NO的生成（P＜0.01），NO生成量是正常组的2.53倍。与MGO 模型组相比，除1.00 μg/mL 质量浓度LHGJ 复合物以外，0.01、0.10、10.00 μg/mL 质量浓度均能降低ARPE-19 细胞中NO 的生成，具体表现为分别降低13.24、15.23、16.24 μmol/g prot，具有统计学意义（P＜0.05）。说明一定剂量质量浓度的LHGJ复合物可抑制体内NO 的生成。此外，目前还没有研究针对蓝莓、黑醋栗、枸杞及决明子复合物对NO 的作用效果，但有研究表明50～150 mg/kg 的决明子提取物给药可以将NO 含量降低6～17 μmol/L[28]。

图5 LHGJ 复合物质量浓度对MGO 诱导APRE-19 细胞NO 含量（a）、SOD 活力（b）与GSH-Px 活力（c）的影响Fig.5 The effects of LHGJ complex at different concentrations on NO content (a),SOD activity (b) and GSH-Px activity (c)of APRE-19 cells induced by MGO

SOD 是机体抵御外界氧化应激的第一道防线，GSH-Px 是机体内重要的过氧化物分解酶，可以催化GSH 与过氧化物还原为无害羟基物质，从而发挥一直眼部细胞氧化损伤的作用[1]。由图5b 所知，与对照组相比，MGO 干预能显著降低ARPE-19 细胞中SOD 的活性（P＜0.01）；与MGO 组相比，LHGJ 复合物能剂量依赖性的提高ARPE-19细胞SOD 的活性，其中0.10、1.00、10.00 μg/mL LHGJ 复合物处理后，ARPE-19 细胞中SOD 的活性分别显著升高5.23（P＜0.05）、6.01（P＜0.01）、7.43 U/mg（P＜0.01）。由图5c 所知，与对照组相比，MGO 干预能显著抑制ARPE-19 细胞中GSHPx 的活力（P＜0.05），与MGO 组相比，LHGJ 复合物能剂量依赖性的提高ARPE-19 细胞GSH-Px的活性。其中，1.00、10.00 μg/mL LHGJ 复合物处理后，ARPE-19 细胞中GSH-Px 的活力分别升高13.32 及22.42 U/mg，具有显著性（P＜0.05）。刘垚杰等[29]也研究发现，在枸杞剂量为460 mg/kg·bw 时，枸杞、菊花与熟地黄组方对ARPE-19 细胞SOD 与GSH-Px 活力提高3.00、2.98 U/mg。本研究通过对比，可以发现LHGJ 复合物对SOD 与GSH-Px 活力增加程度高于枸杞与熟地黄组方，这可能与LHGJ 复合物中蓝莓花色苷的添加有关。尹利端等[30]研究发现，蓝莓花色苷各剂量组均能显著提高视网膜SOD 的活性，也证实了蓝莓花色苷的有效添加。

3 结论

本研究以蓝莓、黑醋栗、枸杞与决明子为原料进行配比制备LHGJ 复合物，其质量浓度为0～10.00 μg/mL时，对ARPE-19 细胞活力无影响，不存在潜在毒性。同时，以对照组与MGO 诱导细胞氧化应激损伤模型下细胞活力与抗氧化能力变化为研究指标，探究LHGJ 复合物对眼部APRE-19 细胞损伤的保护作用时，结果表明，LHGJ 复合物可以保持氧化应激损伤状态ARPE-19 细胞的生物学功能完整性，充分发挥其保护眼部细胞的作用，也将为LHGJ 复合物在眼部保护领域的进一步开发应用提供理论依据。相比于其他天然复合物质的眼部保护作用，LHGJ 复合物表现出更强的SOD 与GSH-Px 活力提高能力。综上，本研究进一步实现蓝莓、黑醋栗、枸杞与决明子的实际应用价值，为促进LHGJ 复合物工业化生产奠定了基础。除此之外，由于SOD 与GSH-Px 作为皮肤黑色素生成的抑制因子，因此SOD 与GSHPx 活力的提高可以用来缓解皮肤黑色素沉积，未来可进一步深入研究LHGJ 复合物对皮肤美白的作用。