不同pH值下蛋白氧化对牦牛肉肌原纤维蛋白凝胶特性的影响

屈莎，胡婷，唐善虎，李思宁，郝刚

（西南民族大学食品科学与技术学院，四川成都 610000）

凝胶化作用是肉制品肌原纤维蛋白质（MP）重要的功能性质，也是影响肉制品品质的重要因素。

MP 在形成凝胶的过程中，主要受溶液pH 值、离子强度、蛋白浓度、金属离子等因素的影响。pH值是引起蛋白构象改变的主要因素之一，通过影响MP 分子所带电荷来影响蛋白质分子间的吸引的疏水相互作用和排斥的静电相互作用之间的平衡，进而影响凝胶结构和性质。此外，还可通过调节蛋白质等电点（pI）来改变蛋白质分子之间的作用力进而改变MP 的凝胶性[1]。pI 时蛋白质分子所带净电荷少，表面电荷密度较低，分子间斥力下降，多肽链在疏水相互作用下迅速靠拢，形成无序簇状聚集体，所形成的凝胶透明度不好、粗糙。溶液pH 值远离pI 时，蛋白质静电荷含量较高，如未被屏蔽，电荷密度增大，蛋白质分子之间缔合速度缓慢，容易形成有序聚集体，蛋白凝胶透明且细腻。

蛋白质氧化被认为是食品变质的原因之一，它对食品质量的影响包括嫩度降低、变色和风味劣变[2]。蛋白质氧化普遍存在于肉及肉制品的加工和储存过程中，氧化会造成蛋白质发生主链（肽键）断裂、氨基酸侧链修饰以及蛋白质分子间共价交联，从而会引起蛋白质功能特性包括凝胶特性、保水性和乳化特性发生改变[3]。本研究以牦牛肉肌原纤维蛋白热凝胶为研究对象，探究不同pH 值下不同H2O2浓度对MP 凝胶特性的影响，从质构、持水、白度、流变学特性、微观结构、分子间作用力等方面，探究不同pH 下不同氧化程度对MP 凝胶特性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牦牛肉，购于四川省阿坝州红原县自然放牧区。

EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基酸)四乙酸），2,4-二硝基苯肼，1-苯氨基萘 -8-磺酸，戊二醛，购于成都科隆化学品有限公司，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

5804R 冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；T-25高速匀浆机，德国IKA 公司；UV1810S 紫外分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；CM-700d 色差仪，日本KONICAMINOLTA，TA.XT-Plus 质构分析仪，Stable Micro Systems，流变仪美国TA 仪器，场发射扫描电镜，Thermo Scientific Apreo 2C。

1.3 试验方法

1.3.1 肌原纤维蛋白提取

参考Park 等[4]的方法从牦牛背最长肌中分离提取肌原纤维蛋白，最终得到的MP 于4 ℃保存，48 h内使用。蛋白质浓度用双缩脲法测定，采用牛血清蛋白作为标准蛋白。

1.3.2 蛋白氧化模型

参考Xiong 等[5]的方法略作修改：将肌原纤维蛋白质用15 mmol/L PIPES（0.6 mol/L NaCl，pH 值6.0）溶解后，分散于Fenton 氧化体系（0.01 mmol/L FeCl3，0.1 mmol/L 抗坏血酸，5、10、15、20、40、60 mmol/L H2O2）中，控制蛋白质量浓度在25 mg/mL，用NaOH和HCl 调节所需pH 值（5.0、6.0、7.0、8.0），于4 ℃下氧化24 h，以1 mmol/L EDTA（最终浓度）终止氧化。对照组用去离子水代替H2O2。

1.3.3 蛋白凝胶的制备

将蛋白溶于1 mmol/L 的不同pH 值（pH 值5.0、6.0、7.0、8.0）的磷酸缓冲液（含0.1 mol/L NaCl）中，蛋白质量浓度调整到40 mg/mL，搅拌均匀后用1 mol/L NaOH 或HCl 将蛋白溶液调整至所需pH 值，分别取20 mL、5 mL 蛋白溶液装入密封样品瓶中，置于水浴中加热，25 ℃线性升温至80 ℃，保温20 min 取出，冰水浴冷却后存放于4 ℃冰箱过夜，用于质构、白度和扫描电镜的测定。

1.3.4 白度

参考陆剑锋等[6]的方法测定蛋白凝胶的白度值。测前用标准白（L*=25.60，a*=-0.30，b*=0.27）校正色差计。凝胶白度值计算如下：

式中：

W——白度值，

L*——亮度值；

a*——红度值（正、负值分别表示偏红、偏绿）；

b*——黄度值（正、负值分别表示偏黄、偏蓝）。

1.3.5 质构

用质构仪对蛋白凝胶质构进行测定，采用P/50探头，P5 探头（直径5 mm），物性参数设定为测前速度1.0 mm/s，测试速度0.5 mm/s，测后速度1.0 mm/s，探头深入距离10 mm，触发力5 g。一次测定过程中探头下压两次，每个样品重复三次测定，硬度是第一次压缩时的最大峰值[7]。

1.3.6 持水性

持水性测定方法参考Delles 等[8]的方法。称取5 g 凝胶样品记为M1，用滤纸包好放入10 mL 离心管中，3 000 r/min 离心10 min 后称量凝胶质量记为M2。凝胶持水性计算：

式中：

W——持水性（WHC），%；

M1——离心前凝胶质量，g；

M2——离心后凝胶质量，g。

1.3.7 流变特性

将样品置于已校正好的流变仪平台上，并将盖板表面用硅油密封，以防止水分蒸发。所选夹具为φ=25 mm 的平行板，平行板间距为1 mm。测试过程在恒定振荡频率1.0 Hz 下进行温度扫描，升温扫描范围为25～80 ℃，升温速率为1.0 ℃/min，测定升温过程中弹性模量G′的变化[7]。

1.3.8 分子间相互作用力

参考冯美琴等[9]的方法，略作修改。将1 g MP与9 mL 的五种不同变性溶液捣碎。这些变性溶液如 下：（A）0.05 mol/L NaCl，（B）0.6 mol/L NaCl，（C）0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L 尿 素，（D）0.6 mol/L NaCl+8 mol/L 尿 素，（E）0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+1.5 mol/Lβ-巯基乙醇。将匀浆在4 ℃下平衡1 h，然后以8 000g离心10 min。各组上清液的蛋白质含量按Lowry 法测定。溶液A 和B、C 和B、D 和C、E 和D 之间的蛋白质含量差异分别表示离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键。

1.3.9 微观结构

凝胶样品的取样和固定方法参考Han 等[10]的方法略做修改。具体处理方法如下：将凝胶样品切成小块用质量分数2.5%（pH 值7.3，0.1 mol/L 磷酸缓冲溶液配制）戊二醛于4 ℃条件下固定24 h，然后将样品再用2.5%戊二醛浸泡，于4 ℃条件下备用。样品用0.l mol/L 磷酸缓冲溶液（0.1 mol/L，pH 值7.0）清洗3 次，每次3 min。样品依次用体积分数50%、70%、80%、90%的乙醇溶液梯度脱水15 min，再用100%乙醇脱水3 次，每次30 min。冷冻干燥样品，用双面胶带将样品粘到样品台上，用离子溅射仪给样品镀10 nm 金膜，用扫描电镜观察样品。每个样品观察3 个视野。

1.4 数据处理

数据处理和差异显著性分析分别采用Origin 2022 和SPSS 2020 软件进行，绘图采用Origin 2022软件进行，显著性分析采用Origin 2022（P＜0.05结果显著），所有实验均重复3 次。

2 结果与分析

2.1 白度

图1 不同pH 值下不同H2O2 浓度对MP 凝胶白度值的影响Fig.1 Effect of different H2O2 concentration on MP gel whiteness at different pH values

白度是影响消费者对于肉制品品接受度、偏好度、舒适度的重要因素之一[11]。如图4 所示，随着H2O2浓度的增加，凝胶白度值显著降低（P＜0.05），白度值从最初的86 左右分别降至71.56、78.19、83.34、82.55，即羟自由基对牦牛肉白度值有不利影响。在不同的pH 值条件下，凝胶白度值下降速率也有所不同，当pH 值（5.0、6.0）在等电点附近时，凝胶白度值下降速率大于pH 值（7.0、8.0）偏离等电点的白度值。这可能是由于随着H2O2浓度的增加，MP 发生变性，变性程度越高，羰基含量增加越多，使得光折射下降[12]，白度值也随之发生改变。

2.2 质构

凝胶强度是肉类产品的一项重要指标，可以反应产品的质地和感官质量[13]。如图2 所示，随着蛋白H2O2浓度的增加，凝胶强度值显著下降（P＜0.05）。当H2O2浓度为0 mmol/L 时，不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0）条件下的凝胶强度分别为53.46、61.46、57.16、58.62 g，当H2O2浓度达到60 mmol/L 时，凝胶强度下降至47.28、54.05、49.20、50.68 g，与未氧化的相比，凝胶强度下降了11%左右。在后面的相互作用力的测定中，随着H2O2浓度的增加，疏水相互作用力显著增加，使得MP 与水的结合能力下降，使得MP 凝胶的形成受到抑制。加热后氧化导致MP 容易形成球状聚集体，这时形成的凝胶结构粗糙无序，空隙分布不均匀，致密性下降（可见电镜观察结果）。在MP 凝胶样品中，pH 值为6.0 时凝胶强度最大，pH 值为5.0时凝胶强度最小，但当pH 值进一步增加到8.0 时，蛋白形成的凝胶强度降低。但此结果与倪娜等[14]对羊肉MP 研究的结果相反，她们的研究结果显示羊肉MP 凝胶在pH 值6 时质构最差，pH 值7.5 时质构、持水性最好，这种差距可能是由于原料肉、体系条件的不同导致的。

图2 不同pH 值下不同H2O2 浓度对MP 凝胶质构的影响Fig.2 Effect of different H2O2 concentration on texture of MP gel at different pH values

2.3 持水性

持水性可以反应蛋白凝胶的细腻程度，是热诱导蛋白凝胶的重要功能特性之一[15]。如图3，在同一pH 值条件下，随着H2O2浓度的增加，凝胶持水性显著下降（P＜0.05），与未氧化的相比，当H2O2浓度达到60 mmol/L 时，持水性下降了10%左右。当蛋白被氧化后，蛋白的分子结构和构象发生改变，使得MP 在凝胶过程中的有序聚集受到影响，导致凝胶三维网状结构受到影响，凝胶结构疏松，孔隙变大，使得持水性降低，此外MP 中氨基酸残基的修饰导致凝胶与水之间氢键作用的破坏也可能导致MP 凝胶的失水[16]。当处于不同pH 值远离等电点时，蛋白带有静电荷，凝胶持水性明显提高。pH 值为8.0时蛋白持水性最好，pH 值为5.0 时持水性最差，随着pH 值远离pI，蛋白质表面电荷增多，使得MP具有更好的溶解性和流动性，氧化对凝胶结构影响较低，同时周围更多水通过氢键结合到暴露的蛋白质位点上，凝胶持水性增强[17]。

图3 不同pH 值下不同H2O2 浓度对MP 凝胶持水性的影响Fig.3 Effect of different H2O2 concentration on MP gel water retention at different pH values

2.4 流变学特性

H2O2浓度对牦牛肉MP 凝胶流变性质的影响如图4。pH 值在6.0、7.0、8.0 时，MP 凝胶储能能量（G′）主要经历了升、降、升三个阶段，在凝胶形成区（52 ℃之前）的初始阶段G′较为稳定，随着温度的升高，G′开始升高在50 ℃左右出现第一个峰值，此时肌球蛋白头部发生交联聚合，蛋白凝胶开始形成；此后MP 凝胶G′开始降低并在60 ℃左右到达最低点，此时凝胶处于凝胶减弱区（52～60 ℃），肌球蛋白尾部发生解螺旋，网状结构遭到破坏，增强了蛋白的流动性[18]；60 ℃之后G′开始增加在75 ℃后开始趋于稳定（57～80 ℃凝胶增强区），在此阶段肌球蛋白完全变性，形成凝胶的一些主要作用力交联加强，形成坚硬并且不可逆的蛋白凝胶，同时随着H2O2浓度的增加，出现第一个峰值的温度位置逐渐变小。pH 值为5.0 时，与其他pH 值组相比，初始和终止的G′ 都相对较低，曲线比较平缓，没有明显的峰值出现，这可能是由于在当pH 值接近等点时，分子间相互作用力比较低，疏水性较强使得形成的凝胶较为脆弱。由图4 可知当pH 值为6.0 时G′最高，当其H2O2浓度为5 mmol/L 时其G′与pH 值为7.0 未氧化组类似。

图4 不同pH 值下不同H2O2 浓度对MP 凝胶流变性质的影响Fig.4 Effect of different H2O2 concentration on rheological properties of MP gel at different pH values

2.5 相互作用力

蛋白凝胶三维结构的稳定与化学作用力紧密相关，需要疏水相互作用、氢键、二硫键、离子键等多种作用力的共同作用[19]。从图5 可以看出维持牦牛肉MP 凝胶的主要作用力是以疏水相互作用为主，其次是二硫键、氢键和离子键。随着H2O2浓度的增加，离子键、氢键含量显著下降（P＜0.05），二硫键、疏水相互作用显著增加。这主要是由于 ·OH氧化蛋白诱导氨基酸侧链基团暴露，使得蛋白疏水性增加，导致疏水相互作用增强（P＜0.05），带电基团被氧化后带电性质变化，或者可电离基团在氧化过程中发生了化学反应，比如Lys 的氨基，这都导致了离子键的降低，同时氧化导致的二级结构的改变使得氢键作用力被削弱[20]。随着H2O2浓度的加深，半胱氨酸侧链基团巯基会氧化形成二硫键，使得蛋白质分子间发生交联聚集[21]，二硫键含量增加。而在不同pH 值条件下时，当pH值为5.0，由于蛋白处于pI 附近，蛋白分子所带正负电荷数目基本相等，MP 表面电荷减少，蛋白之间各种作用力相比其它pH 值组都较低，导致大量蛋白聚集靠拢，氧化让蛋白质在未形成凝胶之前就大量交联，氧化的蛋白形成的凝胶结构粗糙无序，凝胶空隙分布不均，同时蛋白之间的其他相互作用力也最低，维持凝胶结构的能力较弱，凝胶致密性较低，保水性较低。随着pH 值偏离等电点（pH 值为6.0），蛋白之间各种相互作用力增加较大，分子间疏水相互作用、氢键、离子键、二硫键与其它pH 组相比含量最高，所带电荷数目最多，这说明pH 值6.0 时MP 氧化对凝胶三维结构的影响相比其它pH 组较弱。但当pH 值更进一步增加时，各种作用力含量却随之降低，这可能是由于随着pH 值进一步远离等电点，蛋白表面电荷进一步增加，静电斥力使得蛋白分子间距离增大，同时蛋白的水合程度增加，使得蛋白之间相互作用降低。

图5 不同pH 值下不同H2O2 浓度对MP 凝胶相互作用力的影响Fig.5 Influence of different H2O2 concentration on MP gel interaction at different pH values

2.6 凝胶微观结构

在上述指标的测定中，pH 值为5.0 时蛋白凝胶的持水性最差，硬度最低，pH 值为6.0 时的凝胶硬度最好，pH 值为8.0 时蛋白凝胶持水性最好，因此扫描电镜主要观察这三个典型pH 值下蛋白氧化（5 mmol/L、60 mmol/L）样品的微观结构。

凝胶的三维网络结构是决定凝胶密度和凝胶强度的重要因素。图6 表示了在不同pH 值下不同H2O2浓度对蛋白凝胶三维结构的影响。pH值为5时，MP 孔隙较大且分布不均匀，同时它有明显的团块状、棒状聚集体，pH 值为6.0 和8.0 时，凝胶网络结构呈现出更加有序的状态。凝胶孔隙多为多孔状，孔径小，且分布均匀、细碎。同时随着H2O2浓度的增加，MP 凝胶致密性下降，网状结构粗糙，空隙分布不均匀，随着H2O2浓度进一步增加，凝胶网状结构破坏的更加严重。氧化使得蛋白质分子间引力和斥力受到影响，导致形成凝胶的主要作用力发生改变，影响了凝胶形成过程中的分子交联。肌原纤维蛋白凝胶中微观结构的形成取决于蛋白质聚集和展开的相对速度，聚集速度慢，有利于蛋白分子充分变性展开，形成高伸展性的直链分子，再缓慢缔合成线状聚集体，形成的凝胶微观结构均匀有序[22]，如果球状蛋白质聚集速度很快，大于蛋白质展开速度，如氧化后的蛋白在还未充分变性展开前就已经在分子之间发生了交联聚集，缔合成球状聚集体，这样形成的凝胶结构粗糙无序。

图6 典型pH 值（5.0、6.0、8.0）下不同H2O2 浓度蛋白凝胶微观结构Fig.6 Microstructure of protein gel with different H2O2 concentrations at typical pH values (5.0,6.0,8.0)

3 结论

蛋白氧化对牦牛肉MP 凝胶特性有显著负面影响（P＜0.05），在不同pH 值下，随着H2O2含量的增加，蛋白凝胶白度、持水、质构显著降低（P＜0.05）。pH 值为5.0 时氧化对凝胶特性影响最为明显，蛋白凝胶持水最低、质构强度最差，凝胶结构松散、无序。pH 值为6.0 时氧化对凝胶影响较弱，蛋白凝胶质构强度最大，三维结构有序、孔径小且均匀分布。pH 值为8.0 时蛋白氧化后形成的凝胶持水性最好，三维结构与pH 值为6.0 组相比略有松散。相互作用力研究表明静电相互作用力和二硫键是维持MP凝胶的主要作用力，随着H2O2含量的增加，离子键、氢键含量下降，静电相互作用力和二硫键含量增加。实验结果表明不同pH 值条件下，蛋白氧化对牦牛肉MP 凝胶都产生了不利影响，但pH 值为6.0时MP 氧化对凝胶特性的负面影响程度最低。