苦竹笋发酵工艺条件优化及成品挥发性成分分析

张长贵，郑耀伟，潘婉舒，张耕

（1.宜宾学院农林与食品工程学部，四川宜宾 644000；2.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾 644000；3.四川彭州广乐食品有限公司，四川彭州 611930）

苦竹笋又名凉笋、甘笋，是竹亚科苦竹（Pleioblastusamarus）的幼嫩芽，在我国的南方地区广泛栽种和分布[1-2]。苦竹笋美味可口，营养丰富，素有“寒土山珍”之美称，属于绿色森林蔬菜。苦竹笋味苦，既是一种常见的菜肴，也是一种中药材，兼具食用和药用价值[3-4]。苦竹笋中富含生物碱类、酚类、黄酮类等生物活性物质，有抗炎、抗菌、抗氧化、降血糖和增强免疫调节等功能[5-7]，还含有丰富的膳食纤维，具有促进肠胃蠕动、降胆固醇和调节肠道菌群的作用[8-10]。

竹笋的加工和食用方法很多，除了鲜食烹饪，还有许多其他的加工方法，例如罐装、腌制、发酵、冷冻、干制等[11]，其中腌制和发酵是常见的加工方式。郑炯等[12]和李梅等[13]分别研究了麻竹笋腌制及其风味物质、毛竹笋在不同预处理方式条件下发酵过程中的营养物质变化；卢宏皓等[14]对竹笋发酵过程中的化学成分变化进行了研究；吕朝燕等[15]研究了盐度对盐腌煮干制方竹笋品质的影响；陈雪莲等[16]研究了益生菌发酵竹笋的发酵液配方和灭青工艺条件。由此可见，目前研究主要集中在对竹笋腌制和发酵过程中理化成分、风味物质变化以及盐度、竹笋预处理方式对品质的影响，而对竹笋的发酵工艺条件的研究鲜见报道，尤其是对苦竹笋的低盐发酵工艺技术研究报道鲜少。

低盐发酵不但可以改善竹笋的风味和品质，而且比非发酵竹笋更加有益于健康，有改善肠道中的微生物菌群、增强免疫力等作用[16]。四川竹资源丰富，特别是有川南竹产业集群核心区域美誉之称的宜宾具有丰富的苦竹笋资源，因此，本试验以苦竹笋为原料，通过自然发酵、接种老坛水发酵、接种乳酸菌粉发酵3 种发酵方式的比较，筛选出最优发酵方式，再采用最优的发酵方式对苦竹笋低盐发酵条件进行优化并对挥发性香气成分进行分析，旨在为苦竹笋的低盐发酵生产和加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 主要材料

苦竹笋、食盐、蔗糖、高度白酒、八角、香叶等香辛料：市售；乳酸菌粉：北京川秀国际贸易有限公司；老坛水：取自宜宾学院食品工艺学实验室；无水柠檬酸（食品级）：潍坊英轩实业有限公司；氯化钙（食品级）：河南石药集团维生药业有限公司。

1.1.2 主要试剂

盐酸、硼酸钠：四川西陇化工有限公司；氢氧化钠：重庆川东化工有限公司；2-6-二氯靛酚、亚铁氰化钾：上海展云化工有限公司；盐酸萘乙二胺、邻苯二甲酸氢钾、乙酸锌：天津化学试剂有限公司；亚硝酸钠、冰乙酸、对氨基苯磺酸：成都科龙化工试剂厂。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

7890A/5975C 气相色谱-质谱联用仪：安捷伦科技（中国）有限公司；ZB-300×2 真空包装机：上海至奔包装机械有限公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头：美国Supelco 公司；SYG-6 水浴锅：常州朗月仪器有限公司；T6 新世纪紫外分光光度计：北京普析仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

原料选择→预处理（预煮、护色、保脆等）→冷却→漂洗→装坛（加食盐、蔗糖、香辛料）→密封→发酵→称量装袋→真空封口→杀菌→成品。

1.3.2 原料选择与预处理

选择新鲜、无病虫害的苦竹笋，将竹笋剥壳、切分，切分的规格为长40 mm、宽10～20 mm 的条块状，然后置于0.2% 柠檬酸和0.3% 氯化钙的混合溶液中预煮后快速冷却，沥干水分备用。

1.3.3 发酵方式筛选

自然发酵：设定笋水比为1∶2（g/mL），先在泡菜坛中加入饮用水，然后添加饮用水质量的4% 食盐、3%蔗糖和适量香辛料混匀，再把预处理好的苦竹笋装入坛中，最后在坛面加适量的高度白酒，盖上坛盖，在室温（20 ℃左右）下自然发酵。

接种乳酸菌发酵（以下简称乳酸菌发酵）：设定笋水比为1∶2（g/mL），先在泡菜坛中加入饮用水，然后添加饮用水质量的0.10%乳酸菌粉（含植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌，3 种菌的总含菌量1.0×109CFU/g）、4% 食盐、3% 蔗糖和适量香辛料混匀，再把预处理好的苦竹笋装入坛中，最后在坛面加适量的高度白酒，盖上坛盖，在室温（20 ℃左右）下发酵。

接种老坛水发酵（以下简称老坛水发酵）：设定笋水比为1∶2（g/mL），先在泡菜坛中加入饮用水，然后添加饮用水质量的6%老坛水、4%食盐、3%蔗糖和适量香辛料混匀，再把预处理好的苦竹笋装入坛中，最后在坛面加适量的高度白酒，盖上坛盖，在室温（20 ℃左右）下发酵。

在发酵过程中，定期对以上3 种发酵方式取样，进行感官评价和理化指标测定，通过比较确定最佳发酵方式。

1.3.4 发酵条件的优化

采用1.3.3 筛选出的发酵方式，利用单因素试验和正交试验相结合的试验方法，筛选最佳发酵工艺条件。

1.3.4.1 单因素试验

采用1.3.3 方法中的乳酸菌发酵法，基础条件为食盐添加量4%、乳酸菌粉接种量0.10%、蔗糖添加量3%、发酵时间5 d。各单因素变量设定为食盐添加量3%、4%、5%、6%、7%、8%，蔗糖添加量1%、2%、3%、4%、5%、6%，乳酸菌粉接种量0.04%、0.07%、0.10%、0.13%、0.16%、0.19%，发酵时间3、4、5、6、7、8 d。单因素试验的笋水比为1∶2（g/mL），并以发酵苦竹笋的总酸含量和感官品评分为评价依据，分别确定食盐添加量、蔗糖添加量、乳酸菌粉接种量、发酵时间。

1.3.4.2 正交试验

在单因素试验基础上，采用L9（34）正交设计，正交试验的因素水平见表1。

表1 正交试验的因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 感官评价方法和标准

评价方法：感官评价指标包括色泽、香气、质地、滋味，感官评价小组由10 名食品专业同学组成，且感官评价小组成员事先接受了科学的感官评价培训。感官评价人员依照感官评分标准对样品进行单独评价，满分100 分，取平均值作为总评分。感官评价标准[17]见表2。

表2 感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards

1.3.6 理化指标检测

总酸含量参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中的酸碱指示剂滴定法进行测定；VC含量采用GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》中的2，6-二氯靛酚滴定法进行测定；亚硝酸盐采用GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法测定。

1.3.7 产品挥发性成分分析

产品挥发性成分分析参考李梅等[18]、蔡玥等[19]的方法，作部分修改，具体如下。

1）样品的处理：取3 g 粉碎后的苦竹笋样品于20 mL 萃取瓶中，50 ℃条件下水浴30 min，用DVB/CAR/PDMS 萃取头顶空吸附30 min，待吸附完成后进行气相色谱-质谱联用技术分析。

2）色谱条件：HP-5 色谱柱，载气为99.999%氦气，流速控制在0.8 mL/min。升温程序为初始温度40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min 升至100 ℃，再以3 ℃/min升至175 ℃，接着以10 ℃/min 升至215 ℃，保持10 min，最后以5 ℃/min 升至250 ℃，总程序61 min。柱箱温度40 ℃，进样口温度250 ℃，进样方式为分流。

3）质谱条件：离子源为电子电离源，离子源温度230 ℃，接口温度230 ℃；溶剂延迟时间2 min，扫描模式为全扫描；质量扫描范围m/z 45～550。

1.4 数据的相关处理与分析

用Excel、Origin、SPSS19 软件处理试验数据和作图；用Duncan 多重比较，对数据差异显著性进行分析（P＜0.05，则差异显著）。

2 结果与分析

2.1 发酵方式的筛选

2.1.1 不同发酵方式对总酸含量的影响

总酸是反映产品发酵程度的特征性指标，发酵方式对总酸含量的影响见图1。

图1 发酵过程中总酸含量的变化Fig.1 Changes in total acid content during fermentation

由图1 可知，总酸含量均随发酵时间的延长而呈升高趋势。发酵时间为2 d 时，老坛水发酵方式的总酸比其他2 种方式的总酸含量高，且三者之间的差异显著（P＜0.05），原因可能是因为老坛水中本来含有乳酸。发酵时间为4 d 时，乳酸菌发酵方式比其他2 种发酵方式的总酸含量高，与自然发酵方式差异显著（P＜0.05），但与老坛水发酵方式差异不显著（P＞0.05）；发酵时间为6 d 时，乳酸菌发酵的总酸含量显著高于老坛水发酵和自然发酵（P＜0.05）；发酵时间超过4 d 时，乳酸菌发酵方式的总酸含量最高；发酵时间超过8 d时，总酸含量增长趋缓，可能是随着总酸的不断累积，产酸菌生长繁殖受到一定程度的抑制[20]，所以产酸趋缓。3 种发酵方式相比，乳酸菌发酵更具有优势，其总体产酸速度更快、产酸量更高。

2.1.2 不同发酵方式对维生素C 含量的影响

维生素C 是发酵过程中稳定性较差的还原性营养物质，是衡量产品营养品质的重要指标之一，发酵方式对维生素C 含量的影响见图2。

图2 发酵过程中VC 含量的变化Fig.2 Changes in VC content during fermentation

由图2 可知，3 种发酵方式的维生素C 含量均呈下降的趋势，其中自然发酵方式的VC含量下降速度最快，老坛水发酵方式次之，乳酸菌发酵方式的VC含量下降速度最缓慢。发酵时间为2 d 时，老坛水发酵方式的VC含量最高，且与自然发酵方式差异显著（P＜0.05），原因可能与加入老坛水使得初期总酸含量较其他2 种发酵方式更高有关；发酵时间超过2 d 时，乳酸菌发酵的VC含量显著高于其他2 种发酵方式（P＜0.05），且3 种发酵方式的VC含量下降速度均随发酵时间的延长而趋缓，原因可能与总酸含量持续上升有关，因为产品的总酸含量越高VC稳定性越强[21]。3 种发酵方式相比，总体上，乳酸菌发酵方式的VC含量最高。

2.1.3 不同发酵方式对亚硝酸盐含量的影响

亚硝酸盐是判断产品安全性的重要指标，发酵方式对亚硝酸盐含量的影响见图3。

图3 发酵过程中亚硝酸盐含量的变化Fig.3 Changes in nitrite content during fermentation

由图3 可知，亚硝酸盐含量均随发酵时间的延长呈先上升后下降的趋势。发酵时间为4 d 时，自然发酵方式的亚硝酸盐含量最高，为（5.52±0.31）mg/kg，且含量显著高于其他2 种发酵方式（P＜0.05）；乳酸菌发酵和老坛水发酵方式则在第6 天出现峰值，分别为（4.22±0.10）、（4.59±0.04）mg/kg，且此时老坛水发酵的亚硝酸盐含量显著高于乳酸菌发酵（P＜0.05）。亚硝酸盐含量随着发酵时间延长而下降，原因可能是随着总酸的不断积累，已生成的亚硝酸盐在较高的酸性环境中被酸分解，也可能是乳酸菌产的亚硝酸还原酶分解亚硝酸盐[22]。3 种发酵方式中，乳酸菌发酵的亚硝酸盐含量在2 d 后比其他2 种方式均更低，所以乳酸菌发酵安全性更高。

2.1.4 不同发酵方式对感官品质的影响

感官评分是产品色泽、香气、滋味、质地的综合性评价指标，不同发酵方式对竹笋感官品质的影响见图4。

图4 不同发酵方式对感官评分的影响Fig.4 Effects of different fermentation methods on sensory score

由图4 可知，3 种发酵方式的感官评分变化趋势一致，均为先上升后下降，原因是发酵时间小于6 d时，苦竹笋发酵时间短，酸味弱、风味物质积累少，口感和风味均不佳；发酵时间超过6 d 时，苦竹笋发酵时间过长，总酸含量升高，使得苦竹笋过酸，且质地较软、口感和风味变差。发酵时间为6 d 时，3 种发酵方式的感官评分均达到最高值，感官评分大小依次为乳酸菌发酵＞老坛水发酵＞自然发酵，且三者差异显著（P＜0.05）。因此，3 种发酵方式相比，乳酸菌发酵的苦竹笋感官品质最优。

综上，以总酸、VC、亚硝酸盐含量和感官评分4 项指标作为评判标准，对比3 种发酵方式对苦竹笋发酵的影响，最终确定最优发酵方式为乳酸菌发酵。

2.2 乳酸菌发酵条件的确定

2.2.1 单因素试验结果

2.2.1.1 食盐添加量对发酵苦竹笋品质的影响

食盐添加量对发酵苦竹笋品质的影响见图5。

图5 食盐添加量对感官评分和总酸含量的影响Fig.5 Effects of salt addition on total acid content and sensory score

食盐在苦竹笋发酵过程中既影响产品的咸淡口味，又影响乳酸菌的生长繁殖。由图5 可知，食盐添加量越大，发酵苦竹笋的总酸含量越低，而感官评分随食盐添加量增加呈现先升高后降低趋势。若食盐添加量过大，不仅造成发酵苦竹笋口感偏咸，风味不协调，还抑制乳酸菌生长，影响发酵产酸速度，致使发酵时间延长。综合考虑，食盐添加量在5%较好，故选择食盐添加量4%、5%、6%进行正交试验。

2.2.1.2 乳酸菌粉接种量对发酵苦竹笋品质的影响

乳酸菌粉接种量对发酵苦竹笋品质的影响见图6。

图6 乳酸菌粉接种量对感官评分和总酸含量的影响Fig.6 Effects of lactic acid bacteria powder addition on total acid content and sensory score

由图6 可知，随着乳酸菌粉接种量的增大，发酵苦竹笋的感官评分呈先升高后降低态势，而总酸含量则一直呈上升趋势，在乳酸菌粉接种量为0.10%时感官评分达到最大值。乳酸菌粉接种量过小，发酵速度缓慢，乳酸菌生长周期延长且受杂菌影响；乳酸菌粉接种量过大，乳酸菌产酸的速度快，发酵苦竹笋太酸、产品风味不佳。综上所述，结合发酵苦竹笋感官评分和总酸含量，乳酸菌粉接种量0.10%为最佳发酵条件，因此选择乳酸菌粉接种量0.07%、0.10%、0.13% 进行正交试验。

2.2.1.3 发酵时间对发酵苦竹笋品质的影响

发酵时间对发酵苦竹笋品质的影响见图7。

图7 发酵时间对感官评分和总酸含量的影响Fig.7 Effects of fermentation time on total acid content and sensory score

由图7 可知，发酵时间为3～5 d 时，其感官评分和总酸含量均随发酵时间的延长而升高，而且在第5 天时，产品的酸味最适口，其感官评分最高；发酵时间超过5 d 时，随着总酸含量继续增加，发酵苦竹笋的酸味逐渐增强，适口性变差，感官评分逐渐降低。由此可见，发酵时间对发酵苦竹笋感官品质和总酸含量影响较大，因此综合考虑，选择发酵时间4、5、6 d 进行正交试验。

2.2.1.4 蔗糖添加量对发酵苦竹笋品质的影响

糖是微生物生长所需的碳源，适量的添加蔗糖有助于发酵的顺利进行，蔗糖添加量对发酵苦竹笋品质的影响见图8。

从图8 可以得出，发酵苦竹笋的感官评分和总酸含量随着蔗糖添加量的增加，呈先升高后降低趋势，可能是因为随着蔗糖添加量的增加，供乳酸菌利用的碳源增多，其发酵速度加快，总酸含量增大，但是过多的加糖会使渗透压过大，从而出现抑制发酵的负面效果，对发酵苦竹笋的风味也有一定的影响。综合考虑，选择蔗糖添加量2%、3%、4%进行正交试验。

2.2.2 苦竹笋乳酸菌发酵的正交试验

正交试验结果用多指标加权综合评分法计算[23]，感官评分与总酸含量2 个指标的权重系数分别为70%和30%，试验结果的最终综合评分=[各试验组的感官评分均值/感官评分最大值）×70%×100+（各试验组的总酸含量均值/总酸含量最大值）×30%×100]，每组做3 次平行试验，计算平均值，试验的加权评分结果及方差分析见表3、表4。

表4 正交试验的方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test results

由表3 的R 值可知，各因素对综合评分的影响程度顺序为C＞A＞D＞B，各因素的最佳组合为A2B3C3D3。

由表4 可以看出，乳酸菌粉接种量无显著性影响（P＞0.05），发酵时间、食盐添加量和蔗糖添加量有极显著性影响（P＜0.01）。

2.2.3 验证试验结果

因2.2.2 中的A2B3C3D3组合不在试验组合内，需做验证试验，将A2B3C3D3与A2B2C3D1比较验证，结果表明：A2B3C3D3综合评分为93.51±2.03，A2B2C3D1综合评分为95.43±2.31，因此，最优组合为A2B2C3D1，即食盐添加量5%、乳酸菌粉接种量0.10%、发酵时间6 d、蔗糖添加量2%。

2.3 产品的挥发性成分分析

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）对发酵苦竹笋产品挥发性成分进行检测，结果见表5，挥发性化合物种类见图9。

图9 挥发性化合物种类Fig.9 Categories of volatile compounds

表5 主要挥发性成分Table 5 Main volatile components

由表5 和图9 可知，发酵苦竹笋产品共检出25 种挥发性成分，其中包括烯烃类7 种，醇类5 种，酮类1 种，酯类7 种，酸类1 种，醚类1 种，其他3 种。

醇类物质具有芳香味，由表5 可知，芳樟醇、4-萜烯醇是本试验发酵苦竹笋产品的主要醇类物质，芳樟醇具有花香、木香等多种香味，香味丰富，郑炯等[24]也在腌制麻竹笋中检测到这种物质，4-萜烯醇具有胡椒香和较淡的泥土香。酯类物质具有复合香味，由表5可知，发酵苦竹笋中挥发性成分中有辛酸乙酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯和水杨酸甲酯等化合物，其中辛酸乙酯为白兰地酒香，正己酸乙酯为水果香，庚酸乙酯为菠萝香，水杨酸甲酯为药草清香[25]，水杨酸甲酯一般存在于天然品的各种精油中。由图9 可知，发酵苦竹笋中烯烃类和酯类物质种类最多，由表5 可知，烯烃类物质包括D-柠檬烯、萜品油烯等7 类，其中D-柠檬烯和萜品油烯都具有柠檬的香味，松油烯具有柑橘香味，含量虽然不多，但对发酵苦竹笋风味有一定的影响。此外，在产品中检测出的酸类物质只有乙酸一种，可能是因为产品发酵的时间短所致。醚类物质也只有一种，通过查阅相关文献，发现这类物质可能是因为发酵过程中加入的香辛料带来的。

发酵苦竹笋中不同挥发性化合物的相对含量见图10。

图10 不同挥发性化合物的相对含量Fig.10 Relative content of different volatile compounds

由图10 可知，醇类、酯类、烯烃类、醚类、酸类、酮类和其他物质的相对含量依次为48.13%、33.69%、11.99%、4.16%、0.22%、0.19%和1.62%，相对含量最高的是醇类，说明醇类物质对发酵苦竹笋的风味有较大的影响，其次是酯类、烯烃类和醚类，而酸类和酮类的含量相对较少。

3 结论

通过对3 种不同发酵方式的比较，发现乳酸菌发酵方式的亚硝酸盐含量较其他2 种发酵方式低，VC含量和感官评分更高，发酵产酸速度更快，故最佳发酵方式为乳酸菌发酵；最优工艺参数是食盐添加量5%、乳酸菌粉接种量0.10%、发酵时间6 d、蔗糖添加量2%，加工的发酵苦竹笋经杀菌后测定其挥发性成分，检出25 种成分，包括醇类物质5 种，酯类物质7 种，烯烃类物质7 种，醚类物质1 种，酸类物质1 种，酮类物质1 种，其他物质3 种，其相对含量依次为48.13%、33.69%、11.99%、4.16%、0.22%、0.19%、1.62%。